מחסום הדם-חוט השדרה קשור היטב ויש לו חדירות מוגבלת. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לפתוח בבטחה ובאופן ארעי את מחסום הדם-עמוד השדרה, באמצעות מיקרו-בועות ואולטרסאונד ממוקד. טכניקה זו מאפשרת למקם את פתיחת מחסום הדם-חוט השדרה למקטע חוט השדרה הממוקד.
בנוסף, ניתן לאשר את ההפרעה בקלות באמצעות תצפית חזותית או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה יכול להיחקר בשל הפוטנציאל שלו בשיפור מתן טיפולים גנטיים, או תרופות לחוט השדרה לטיפול בגידולים, ניוון או פציעה. מי שתדגים את ההליך תהיה מגאנה בהימרדי.
סטודנטית מצטיינת לרפואה מהמעבדה שלי, שביום יום מגשרת על הפער בין הנדסה לרפואה. כדי להתחיל, לרכוש מערכת מתמרים אולטרסאונד ממוקד עם מפרט מספיק כדי להשיג מחסום דם-חוט השדרה, או פתחי BSCB בחולדות. הדביקו את מחזיק הגשושית המודפס בתלת-ממד ואת חרוט המים על המתמר.
ודא שיש אטם אטום למים בין החרוט למתמר. מקבעים את קרום הפוליאסטר המעוקר, בעובי 50 מיקרון, שקוף אקוסטית, לתחתית חרוט המים באמצעות גומייה. מלאו את חרוט המים במים נטולי גז ונטולי יונים, באמצעות צינורות הכניסה והיציאה.
הימנעו מבועות אוויר בתוך החרוט, מכיוון שהן עלולות לשבש את הצימוד האקוסטי בין המתמר למטרה. בשלב זה, קרום מיילר צריך להיות מנופח מעט. חבר את ציוד הנהיגה המכיל את מחולל הגלים ומגבר כונן תדר הרדיו למתמר.
קבע את הזרוע הסטריאוטקטית ללוחית הקיבוע וחבר את מחזיק הבדיקה לזרוע. רשמו את משקלה של חולדה מורדמת מספראג-דוולי, ובצעו בדיקת צביטת בוהן וזנב, כדי לאשר את ההרדמה. הניחו כרית חימום וכרית ספיגה סטרילית על צלחת הקיבוע.
הניחו את החולדה על כרית הסופג. החל משחת עיניים ומניחים מדחום רקטלי כדי לפקח על טמפרטורת הגוף. מישוש הצלע האחרונה של החולדה, המחוברת לעמוד השדרה בחוליות החזה ה -13.
השתמש בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את הפרווה מהמשטח הגבי בין הצלע האחרונה לצוואר. נגבו את העור החשוף בגזה טבולה ב-10% יודופובידון. יוצרים חתך בקו האמצע באמצעות מספריים בקשתית ומנתחים דרך הפאשיה עד לחשיפת התהליכים בעמוד השדרה והלמינה.
הסר את העצם עם פטמי עצם אופסט ומספריים קשתית להב זוויתית, עד לחשיפת חוט השדרה. הצמידו את החולדה לצלחת הקיבוע על ידי הידוק התהליכים בעמוד השדרה הסמוכים לכריתת הלמינקטומיה. ואז למשוך מעט על מלחציים כדי להפוך את עמוד השדרה מתוח.
התאם את מיקום המתמר עם הזרוע הסטריאוטקטית עד שהוא ממוקם בדיוק מעל למינקטומיה. הצמידו את מכשיר הלייזר לתחתית חרוט המים והורידו אותו עד שנקודת הלייזר נראית לעין. לאחר מכן התאם את המיקום הרוחבי של המתמר עד שנקודת הלייזר תהיה מעל מיקום המטרה להפרעה BSCB.
הסר את מכשיר הלייזר ומלא את החלל בין החרוט לחוט השדרה בג'ל אולטרסאונד נטול גזים, מבלי להציג בועות אוויר. הגדר את הפרמטרים עבור סוניקציה בפלט הכוח של המתמר. הכינו תמיסת מיקרו-בועות בהתאם להוראות היצרן.
כדי להגדיל את הסיכויים לצנתור ורידים מוצלח בזנב, טובלים את הזנב במים חמים ומניחים חוסם עורקים בבסיס הזנב כדי להגדיל את קוטר הוורידים. לאחר מכן הכנס קטטר וריד זנב 22 מד וסומק עם 0.2 מיליליטר של מלוחים heparinized. יש להזריק מיליליטר אחד לקילוגרם של 3% Evans Blue Dye, או EBD לתוך הצנתר.
לאחר מכן לשטוף את הצנתר עם 0.2 מיליליטר של מלוחים heparinized. אשרו את הצנתור המוצלח של וריד הזנב על ידי בדיקת שינוי צבע כחול בעור, בעיניים או בווריד עמוד השדרה הגבי של החולדה. הזריקו בולוס של 0.2 מיליליטר של מיקרו-בועות לתוך הצנתר ושטפו במי מלח הפריניזציה לפני תחילת הסוניקציה.
לאחר המתת החולדה, הסירו את חוט השדרה והכניסו אותו ל-4% פרפורמלדהיד בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת להחליף את paraformaldehyde עם PBS. כדי להמחיש הפרעה BSCB, בודד קטע של שני סנטימטרים המקיף את מיקום הסוניקציה, באמצעות סכין גילוח.
מחלקים את החתך למקטעים בעובי 10 מיקרון באמצעות מיקרוטום וכתם עם כתם eosin hematoxylin. עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, deparaffinize את השקופית המכילה את החלק חוט השדרה, ואת counterstain עם 25 מיקרוליטר של DAPI מומס בתווך הרכבה. דוגרים על המקטעים בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בחושך כדי למנוע הלבנה.
לאחר הדגירה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצלם את כל השקפים. דמיינו את השקופית המוכתמת בהמטוקסילין ובאוזין באמצעות מיקרוסקופ אור. כלי הדם של חוט השדרה נראים לאחר למינקטומיה, ומראים את וריד עמוד השדרה האחורי, עם מספר כלי דם קטנים יותר המקרינים לרוחב.
לאחר הזרקה תוך ורידית של EBD, הרקמה שמסביב וכלי הדם בעמוד השדרה נראו כחולים. לאחר סוניקציה, כתם כחול הופך גלוי מעל מיקום המטרה, המציין את האקסטרווציה של EBD לתוך פרנכימה לבנה, עקב הפרעה BSCB. כריתת חוט השדרה מהחולדות עם אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה, או סוניקציה LIFU, אישרה אקסטרווזיה לכאורה של EBD לתוך חוט השדרה.
בעוד חולדות מבוקרות שליליות ללא טיפול LIFU לא הראו אקסטרווציה EBD. חוטי השדרה עם סוליקציה LIFU הראו עוצמה גבוהה משמעותית של EBD autofluorescence, מאשר מיתרים שלא קיבלו סוניקציה. עם עוצמות דומות של DAPI נוכח בשניהם.
ניתוח Hematoxylin ו- eosin לא גילה נזק עצבי, דימום או נגעים בחלל במקומות הסוניים. דוגמאות של מיתרים פגועים עקב טיפול לא נכון כירורגי, וסוניקציה בעוצמה גבוהה מוצגות כהשוואה. בחולדות שקיבלו מיקרו-בועות וטיפול LIFU לא נצפה שינוי בניקוד המוטורי, טרום סוניקציה, פוסט-סוניקציה ובמהלך תקופת הישרדות של חמישה ימים.
שינויים מזעריים בטמפרטורת חוט השדרה נצפו לפני, במהלך ואחרי ניתוח סוניקציה. חשוב להגביל את הנזק הניתוחי לחוט במהלך כריתת הלמינקטומיה. הדמיה של הקטעים המוכתמים H ו- E במיקרוסקופיה, תציין אם נגרם נזק כלשהו.
בעקבות הפרעה במחסום הדם-חוט השדרה, באמצעות אולטרסאונד ממוקד, ניתן להזריק לבעלי חיים חומרים אנטינאופלסטיים, או טיפולים גנטיים. התוצאה תקבע אם טכניקה זו יכולה לשפר את מתן הטיפולים, ולהאריך את ההישרדות בסביבה של פתולוגיה של חוט השדרה.
