使用 体内 显微注射和电穿孔的体细胞基因组工程小鼠模型

所提出的协议是一种高度灵活的小鼠输卵管基因组操作方法。它允许在免疫功能良好的环境中形成被未经编辑的细胞包围的零星突变细胞。这对研究癌症的起始是有利的。

该技术的主要优点是它在靶向感兴趣的器官、区域、区域或细胞类型方面具有高度适应性，具有易于互换的突变组合集，所有这些都不需要绝对需要小鼠系。这种方法可以很容易地适用于具有管腔和器官实质的器官。首先，使用微量移液器拉拔器将玻璃毛细管拉入尖点。

使用一对锥形超细尖镊子，在解剖显微镜下剪断拉动的毛细管的尖端以创建一个开口。确保开口不要太大，因为它会损坏输卵管并防止缓慢注射。接下来，将无菌手术设备、显微镜、显微操纵器和电穿孔器放在干净的无菌工作台上或生物安全柜内。

在圆盘上加热加热垫，并将其放在干净、设备齐全的笼子下面。将无菌1X PBS倒入培养皿中。用一把干净的剪刀，将吸水纸切成一厘米的正方形。

将这些放入PBS中浸泡它们。接下来，将拉动的毛细管针连接到夹式显微操纵器上，由磁性支架稳定。将两微升注射液移液到无菌培养皿上。

在显微镜下观察时，使用连接到显微操纵器的气压注射器将一至两微升注射液缓慢吸收到显微注射针中。避免在针头上吸收气泡。麻醉六至八周大的雌性小鼠并皮下施用卡洛芬后，将小鼠放在加热的吸收纸上，背侧朝上。

在每只眼睛上涂抹眼睛润滑剂，以防止手术过程中干燥。通过用一对镊子夹住脚趾确认麻醉停止后，去除预期切口部位周围的背毛，并用防腐剂擦拭裸露的皮肤。用一对直的钝钳捏住裸露的皮肤，并使用一把无菌剪刀沿着身体中线创建一个一厘米长的切口。

使用一对无菌 Adson 镊子捏住并支撑切割部位的一侧。然后，使用一对无菌的、弯曲的锯齿状镊子，轻轻地将皮肤与体壁分开，从中线切口开始并横向移动。将脂肪垫定位在肾脏下方后，使用一对无菌、直的钝钳将体壁直接捏在脂肪垫上方。

使用一把无菌、锋利、尖锐的解剖剪刀在体壁上创建一个小切口，注意避开血管。在仍然用直钝镊钳夹住体壁的同时，将一对无菌、钝、弯曲的镊子插入切口，并扩大在体壁上产生的切口。用钝的弯曲镊子抓住可见的脂肪垫，然后将其拉出孔中，露出卵巢、输卵管和子宫。

用无菌斗牛犬夹夹住脂肪垫，保持生殖轨迹暴露。小心地将麻醉小鼠与生殖轨迹暴露在解剖显微镜的载物台上。调整显微操纵器，以便在显微镜下观察带有溶液的注射针。

然后操纵显微镜轻松观察卵巢、输卵管和子宫。使用一对无菌、锥形、超细尖镊子，握住要注射的输卵管区域。该区域必须与显微注射针的方向对齐。

调整显微操纵器，用显微注射针刺穿输卵管，同时使用锥形超细尖镊子将输卵管送入针头上。轻轻移动显微注射针，确认它已插入输卵管。慢慢注入1微升注射液和5%过滤台盼蓝入输卵管中，同时观察蓝色溶液的运动和输卵管腔的扩张。

避免将任何气泡引入管腔。注射后，从输卵管中取出针头，并用一张预先浸泡在PBS中的吸收纸覆盖目标区域。用一把电极镊子抓住预先浸泡的纸和要瞄准的区域，然后从身体上拉开。

使用三个 30 伏的单极性脉冲以 1 秒的间隔对目标区域进行电穿孔 50 毫秒。电穿孔后，取出吸收纸并将鼠标放回加热垫上。松开斗牛犬夹，小心地将暴露的生殖轨道推回体壁下方。

在两个输卵管都电穿孔并放回体壁下方后，使用持针器抓住针头。使用一对无菌、弯曲、锯齿状的镊子捏住并支撑切割部位的一侧。然后，使用持针器操纵缝合线并闭合伤口。

将鼠标移到放在加热垫顶部的干净笼子中并监视，直到鼠标处于活动状态。使用三毫米或一毫米镊子型电极电穿孔后，用TdTomato标记的目标区域仅限于远端输卵管上皮。使用三毫米镊子型电极时，与仅针对最远端（漏斗）相比，使用一毫米镊子型电极靶向的壶腹区域要大得多。

在目标区域，用TdTomato标记的电穿孔细胞随机分布在非电穿孔细胞中。此外，电穿孔细胞仅限于粘膜上皮，在下面的基质或肌肉层中未观察到。为了确认CRISPR介导的基因组编辑，可以通过FACS分选分离荧光细胞进行DNA分离和测序。

这使我们能够量化靶向等位基因的频率，跟踪样品之间的独特通信，以跟踪免疫功能环境中原发肿瘤和转移的体内冠状演变。