Представленный протокол представляет собой очень гибкий метод манипуляций с геномом в яйцеводе мыши. Это позволяет формировать спорадически мутировавшие клетки, окруженные неотредактированными клетками, в иммунокомпетентной среде. Это выгодно для изучения инициации рака.
Основным преимуществом этого метода является его высокая адаптивность при нацеливании на интересующий орган, область, область или тип клеток с легко взаимозаменяемыми наборами комбинаций мутаций, и все это без абсолютной необходимости в мышиной линии. Этот метод может быть легко адаптирован для использования в органах с просветом, а также в паренхиме органа. Для начала втяните стеклянную капиллярную трубку в острую точку с помощью съемника микропипетки.
Используя пару конических щипцов с ультратонким наконечником, отрежьте заостренный конец вытянутой капиллярной трубки под рассекающим микроскопом, чтобы создать отверстие. Убедитесь, что отверстие не слишком большое, так как это повредит яйцевод и предотвратит медленную инъекцию. Затем разместите стерильное хирургическое оборудование, микроскоп, микроманипулятор и электропоратор на чистом стерильном стенде или внутри шкафа биобезопасности.
Нагрейте грелку на диске и поместите ее под чистую, полностью оборудованную клетку. Налейте стерильный 1X PBS в чашку Петри. Чистыми ножницами разрежьте впитывающую бумагу на квадраты размером один на один сантиметр.
Бросьте их в PBS, чтобы они замочились. Далее прикрепите натянутую капиллярную иглу к микроманипулятору с зажимным креплением, стабилизированному магнитным креплением. Пипеткой налейте два микролитра раствора для инъекций на стерильную чашку Петри.
Наблюдая под микроскопом, медленно набирайте один-два микролитра раствора для инъекций в иглу для микроинъекций с помощью шприца под давлением воздуха, прикрепленного к микроманипулятору. Избегайте попадания пузырьков в иглу. После обезболивания шести-восьминедельной самки мыши и введения карпрофена подкожно поместите мышь на нагретую абсорбирующую бумагу тыльной стороной вверх.
Нанесите смазку для глаз на каждый глаз, чтобы предотвратить высыхание во время операции. После подтверждения остановки анестезии, защипнув палец ноги щипцами, удалите дорсальный мех вокруг предполагаемого места разреза и протрите голую кожу антисептиком. Используйте пару прямых тупых щипцов, чтобы ущипнуть голую кожу и сделать разрез длиной в один сантиметр вдоль средней линии тела с помощью стерильных ножниц.
Зажмите и удерживайте одну сторону места разреза с помощью пары стерильных щипцов Адсона. Затем, используя пару стерильных, изогнутых, зазубренных щипцов, аккуратно отделите кожу от стенки тела, начиная со среднего разреза и двигаясь в боковом направлении. Найдя жировую подушку ниже почки, используйте пару стерильных, прямых, тупых щипцов, чтобы защемить стенку тела непосредственно над жировой подушкой.
Сделайте небольшой разрез на стенке тела с помощью стерильных, острых, заостренных рассекающих ножниц, стараясь избегать кровеносных сосудов. Продолжая зажимать стенку тела прямыми тупыми щипцами, вставьте в разрез пару стерильных, тупых, изогнутых щипцов и расширьте разрез, созданный в стенке тела. Возьмитесь за видимую жировую подушку тупыми, изогнутыми щипцами и вытащите ее из отверстия, чтобы обнажить яичник, яйцевод и матку.
Держите репродуктивную дорожку открытой, зажимая жировую подушку стерильным бульдожьим зажимом. Осторожно поместите анестезированную мышь с обнаженной репродуктивной дорожкой на столик препарирующего микроскопа. Отрегулируйте микроманипулятор таким образом, чтобы инъекционная игла с раствором наблюдалась под микроскопом.
Затем манипулируйте микроскопом, чтобы легко наблюдать яичник, яйцевод и матку. Используя пару стерильных, конических щипцов с ультратонким наконечником, удерживайте область яйцевода, подлежащую инъекции. Область должна совпадать с направлением иглы для микроинъекций.
Отрегулируйте микроманипулятор так, чтобы проколоть яйцевод иглой для микроинъекций, одновременно подавая яйцевод на иглу с помощью конических щипцов с ультратонким наконечником. Осторожно переместите иглу для микроинъекций, чтобы убедиться, что она была введена в яйцевод. Медленно вводят в яйцевод один микролитр инъекционного раствора и 5%-ный отфильтрованный трипановый синий, наблюдая при этом за движением синего раствора и расширением просвета яйцевода.
Избегайте попадания пузырьков в просвет. После инъекции извлеките иглу из яйцевода и покройте область, на которую будет нацелено, куском впитывающей бумаги, предварительно пропитанной PBS. Возьмитесь за предварительно пропитанную бумагу и область, на которую нужно нацелиться, пинцетом электродов и отодвиньте от тела.
Электропорируйте целевую область, используя три униполярных импульса на 30 вольт в течение 50 миллисекунд с интервалом в одну секунду. После электропорации удалите впитывающую бумагу и поместите мышь обратно на грелку. Разжмите бульдожий зажим и осторожно протолкните обнаженную репродуктивную дорожку обратно под стенку тела.
После того, как оба яйцевода были электропорированы и помещены обратно под стенку тела, используйте иглодержатель, чтобы захватить иглу. Зажмите и удерживайте одну сторону места разреза с помощью пары стерильных, изогнутых, зубчатых щипцов. Затем используйте иглодержатель, чтобы манипулировать швом и закрыть рану.
Переместите мышь в чистую клетку, расположенную поверх грелки, и наблюдайте, пока мышь не станет активной. При электропорации с использованием трех- или одномиллиметровых электродов пинцетного типа целевая область, помеченная TdTomato, была ограничена дистальным эпителием яйцевода. С помощью трехмиллиметровых электродов пинцетного типа была нацелена гораздо большая площадь ампул по сравнению с нацеливанием только на дистальный самый кончик, инфундибулум, с использованием одномиллиметровых электродов пинцетного типа.
В целевой области электропорированные клетки, отмеченные TdTomato, были случайным образом распределены между неэлектропорированными клетками. Кроме того, электропорированные клетки были ограничены эпителием слизистой оболочки и не наблюдались в нижележащем стромальном или мышечном слое. Чтобы подтвердить CRISPR-опосредованное редактирование генома, флуоресцентные клетки могут быть выделены с помощью сортировки FACS для выделения и секвенирования ДНК.
Это позволяет нам количественно оценить частоту целевых аллелей, отслеживать уникальные коммуникации между образцами, чтобы проследить корональную эволюцию первичной опухоли и метастазов in vivo в иммунокомпетентной среде.
