البروتوكول المقدم هو طريقة مرنة للغاية لمعالجة الجينوم في قناة البيض الفأر. يسمح بتكوين خلية متحولة بشكل متقطع محاطة بخلايا غير محررة داخل بيئة مناعية. هذا مفيد لدراسة بدء السرطان.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قدرتها العالية على التكيف في استهداف عضو أو منطقة أو منطقة أو نوع خلية من الاهتمام بمجموعات قابلة للتبديل بسهولة من مجموعات الطفرات ، كل ذلك دون الحاجة المطلقة لخط الماوس. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للاستخدام في الأعضاء ذات التجويف وكذلك حمة الأعضاء. للبدء ، اسحب أنبوبا شعريا زجاجيا إلى نقطة حادة باستخدام مجتذب micropipite.
باستخدام زوج من الملقط المدبب ذو الأطراف الدقيقة للغاية ، قم بقص الطرف المدبب للأنبوب الشعري المسحوب تحت مجهر تشريح لإنشاء فتحة. تأكد من أن الفتحة ليست كبيرة جدا ، لأنها ستتلف قناة البيض وتمنع الحقن البطيء. بعد ذلك ، قم بترتيب معدات الجراحة المعقمة ، والمجهر ، والمعالج الدقيق ، والكهربائي على مقعد نظيف ومعقم أو داخل خزانة السلامة البيولوجية.
سخني وسادة التدفئة على قرص وضعها تحت قفص نظيف ومجهز بالكامل. صب معقم 1X PBS في طبق بتري. باستخدام مقص نظيف ، قم بقطع الورق الماص إلى مربعات واحدة تلو الأخرى.
قم بإسقاطها في برنامج تلفزيوني لنقعها. بعد ذلك ، قم بتوصيل الإبرة الشعرية المسحوبة ب micromanipulator المثبت بالمشبك ، والذي تم تثبيته بواسطة حامل مغناطيسي. ماصة 2 ميكرولتر من محلول الحقن على طبق بتري معقم.
أثناء المراقبة تحت المجهر ، خذ ببطء واحدا إلى اثنين ميكرولتر من محلول الحقن في إبرة الحقن المجهري باستخدام المحقنة المضغوطة بالهواء المتصلة بالمناور الدقيق. تجنب تناول الفقاعات في الإبرة. بعد تخدير أنثى فأر تبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع وإعطاء كاربروفين تحت الجلد ، ضع الماوس على ورقة ماصة ساخنة مع توجيه الجانب الظهري لأعلى.
ضع مادة تشحيم العين على كل عين لمنع الجفاف أثناء الجراحة. بعد التأكد من توقف التخدير عن طريق قرص إصبع القدم بزوج من الملقط ، قم بإزالة الفراء الظهري حول موقع الشق المحتمل وامسح الجلد العاري بمطهر. استخدم زوجا من الملقط المستقيم غير الحاد لقرص الجلد العاري وإنشاء شق بطول سنتيمتر واحد على طول خط الوسط في الجسم باستخدام مقص معقم.
اضغط وامسك جانبا واحدا من موقع القطع باستخدام زوج من ملقط Adson المعقم. بعد ذلك ، باستخدام زوج من الملقط المعقم والمنحني والمسنن ، افصل الجلد برفق عن جدار الجسم ، بدءا من شق خط الوسط والتحرك بشكل جانبي. بعد تحديد موقع وسادة الدهون أسفل الكلى ، استخدم زوجا من الملقط المعقم والمستقيم وغير الحاد لقرص جدار الجسم مباشرة فوق وسادة الدهون.
قم بعمل شق صغير في جدار الجسم باستخدام مقص تشريح معقم وحاد ومدبب ، مع الحرص على تجنب الأوعية الدموية. مع الاستمرار في قرص جدار الجسم بالملقط المستقيم وغير الحاد ، أدخل زوجا من الملقط المعقم وغير الحاد والمنحني في الشق وقم بتوسيع الشق الذي تم إنشاؤه في جدار الجسم. أمسك وسادة الدهون المرئية بالملقط الحاد والمنحني واسحبها من الحفرة لفضح المبيض وقناة البيض والرحم.
حافظ على المسار التناسلي مكشوفا عن طريق تثبيت وسادة الدهون بمشبك البلدغ المعقم. ضع الماوس المخدر بعناية مع تعرض المسار التناسلي على مرحلة المجهر التشريحي. اضبط المعالج الدقيق بحيث يتم ملاحظة إبرة الحقن مع المحلول تحت المجهر.
ثم تعامل مع المجهر لمراقبة المبيض وقناة البيض والرحم بسهولة. باستخدام زوج من الملقط المعقم والمدبب وذو الأطراف الدقيقة للغاية ، أمسك منطقة قناة البيض المراد حقنها. يجب أن تتماشى المنطقة مع اتجاه إبرة الحقن المجهري.
اضبط المعالج الدقيق لثقب قناة البيض بإبرة الحقن المجهري ، مع تغذية قناة البيض في نفس الوقت على الإبرة باستخدام ملقط مدبب ودقيق للغاية. حرك إبرة الحقن المجهري برفق للتأكد من إدخالها في قناة البيض. حقن ببطء ميكرولتر واحد من محلول الحقن و 5 ٪ من التريبان الأزرق المصفى في قناة البيض ، مع مراقبة حركة المحلول الأزرق وتوسيع تجويف قناة البيض.
تجنب إدخال أي فقاعات في التجويف. بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة من قناة البيض وقم بتغطية المنطقة المراد استهدافها بقطعة من الورق الماص المنقوع مسبقا في برنامج تلفزيوني. أمسك الورق المنقوع مسبقا والمنطقة المراد استهدافها بزوج من ملاقط الأقطاب الكهربائية واسحبها بعيدا عن الجسم.
قم بإلكتروبور المنطقة المستهدفة باستخدام ثلاث نبضات أحادية القطب عند 30 فولت لمدة 50 مللي ثانية بفواصل زمنية مدتها ثانية واحدة. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة الورق الماص ووضع الماوس مرة أخرى على وسادة التدفئة. قم بفك مشبك البلدغ وادفع بعناية المسار التناسلي المكشوف للخلف أسفل جدار الجسم.
بعد أن يتم كهربية قناتي البيض ووضعهما مرة أخرى تحت جدار الجسم ، استخدم حامل إبرة للإمساك بالإبرة. اضغط على جانب واحد من موقع القطع وامسك به باستخدام ملقط معقم ومنحني ومسنن. ثم استخدم حامل الإبرة لمعالجة الخيط وإغلاق الجرح.
حرك الماوس إلى قفص نظيف يوضع أعلى وسادة التدفئة والشاشة حتى يصبح الماوس نشطا. عند التثقيب الكهربائي باستخدام أقطاب كهربائية من نوع الملقط ثلاثة أو واحد ملليمتر ، اقتصرت المنطقة المستهدفة الموسومة ب TdTomato على ظهارة قناة البيض البعيدة. باستخدام أقطاب كهربائية من نوع الملقط بثلاثة ملليمترات ، تم استهداف مساحة أكبر بكثير من الأمبولة مقارنة باستهداف الطرف البعيد فقط ، وهو infundibulum ، باستخدام أقطاب كهربائية من نوع الملقط ملليمتر واحد.
في المنطقة المستهدفة ، تم توزيع الخلايا الكهربائية المميزة بواسطة TdTomato بشكل عشوائي بين الخلايا غير المكهربة. بالإضافة إلى ذلك ، اقتصرت الخلايا المكهربة على ظهارة الغشاء المخاطي ولم تلاحظ في الطبقة اللحمية أو العضلات الأساسية. لتأكيد تحرير الجينوم بوساطة كريسبر ، يمكن عزل الخلية الفلورية عن طريق فرز FACS لعزل الحمض النووي وتسلسله.
يتيح لنا ذلك تحديد تواتر الأليلات المستهدفة وتتبع الاتصالات الفريدة بين العينة لمتابعة التطور الإكليلي في الجسم الحي للورم الأولي وورم خبيث في بيئة مناعية.
