纳米纤维阵列是在纳米相材料科学中心制造的，该中心是能源部科学用户设施办公室（提案ID：CNMS2019-103和CNMS2022-A-1182）。CNMS的支持是通过同行评审的提案系统授予的，并免费提供给打算发表其结果的成功申请人（http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml）。我们感谢Kevin Lester和CNMS在纳米纤维阵列生产方面的帮助。我们感谢 John Caughmen 博士、Timothy McKnight 博士、Amber Webb 博士、Daryl Briggs 和 Travis Bee 对实验设计的重要讨论。我们感谢Adam Rondinone博士提供PECVD机器的原理图。我们感谢莱斯利·卡罗尔（Leslie Carol）的科学插图。这项工作由美国能源部生物成像科学计划、科学、生物与环境研究办公室、DE-SC0019104和美国农业部资助，电话：2021-67013-34835。JMM得到了美国农业部：国家粮食和农业研究所：农业和食品研究计划博士前奖学金2021-67034-35167的支持。

1. VACNFs生产（图2和图3）
<ol><li>用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）495 A4旋转涂覆硅晶圆，在4000rpm下抗蚀，并在180°C下烘烤5分钟。 注意： 让晶圆冷却 10 秒，然后再进行下一步。</li>
	<li>旋转涂上第二层抗蚀剂（PMMA 950 A2）并在180°C下烘烤5分钟。</li>
	<li>使用电子束光刻技术在3 mm x 3 mm阵列中以指定的横向间距（间距：10μm或35μm）定义直径为300nm的催化剂点。</li>
	<li>在 30-40 mL 的 1：3 甲基异丁基酮：异丙醇 （IPA） 中显影光刻胶 1.5 分钟，然后用 IPA 冲洗并用 N2 干燥。 注意：使用明场显微镜（20倍物镜）检查点阵列。</li>
	<li>在硅蚀刻机的氧等离子体（渣渣）中暴露 6 秒，清洁残留光刻胶的晶圆。</li>
	<li>使用电子束蒸发首先沉积金属粘合层（Ti 或 Cr，10 nm），然后沉积第二层，即 Ni 催化剂（130 nm 或 150 nm）。在 Ti 或 Ni 金属沉积过程中，在 10 kV 时将电流保持在 0.2 A 以下，压力保持在 5 x 10-6 Torr 以下，并且沉积速率保持在 ~1 A/s 以进行视线沉积。</li>
	<li>使用顺序浴超声处理去除沉积在底层光刻胶层上的金属 （Ni），使 Ni 直接沉积在硅片上。这个过程称为升空。<ol><li>为此，准备3个装有丙酮的容器，并在丙酮中对晶圆进行超声处理1分钟;在室温（RT，20°C）下以35kHz的频率重复3次。用 IPA 冲洗并用 N2 晾干。 注意： 切勿让丙酮在晶圆上干燥。最后一次丙酮超声处理后，立即用IPA冲洗，然后用N2 气体干燥。如果在任何时候晶圆过早干燥（在IPA冲洗之前），则可能无法去除所有多余的金属和光刻胶，并且丙酮会留下残留物。</li>
	</ol></li>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM）检查催化剂形状的几何形状。要捕获 VACNF 芯片的 SEM 图像，请将载物台倾斜 30° 角并使用 1-3 kV 的电压，光束电流为 ~100 pA，工作距离为 ~5 mm。 注：催化剂应看起来像一个曲棍球（一个紧凑的圆柱体）（图4）。紧凑型圆柱体的高度应反映沉积在硅片上的镍的厚度。如果Ni点的轮廓很高，顶部看起来是凹陷的，类似于火山（图4），那么催化剂更有可能脱湿成多个Ni液滴，导致碳纳米纤维9（图4和图5）。这些问题可能是由于金属蒸发过程中的光刻胶熔化造成的，因为沉积时间长或剥离程序存在问题（图 4 和图 5）。</li>
	<li>将硅晶片切成四等份，并将其与乙炔/氨混合物一起放入直流等离子体增强化学气相沉积室（dc-PECVD）中。优化生长参数以控制纳米纤维的长度和锥度（尖端<200 nm）。<ol><li>使用 1-1.5 A 的电流和 440-560 V 的电压范围。在生长纤维时，使用氨流的预处理阶段，同时机器和基材加热到620°C。 确保在开始等离子体之前打开碳源（乙炔）10 秒。 注意：在需要优化PECVD机器运行参数的情况下，使用四分之一晶圆。为了生产长度大于 40 μm 且尖端直径小于 200 nm 的纤维，建议采用以下参数：Ni 催化剂厚度为 130 nm，使用电流为 1.75 A，生长时间为 70 min，乙炔：氨比为 45 标准立方厘米/分钟 （sccm）：100 sccm。Ni厚度为150nm，使用电流为1.5 A，生长时间为80 min，乙炔：氨比为48 sccm：100 sccm。无论催化剂厚度如何，都使用以下参数来生长 VACINF：生长温度为 620 °C，等离子体过程中的压力为 10 torr，喷头高度为 20 mm（图 6）。</li>
	</ol></li>
	<li>使用SEM以30°倾斜评估所得纤维的几何形状，加速电位为1 kV。 注意：最佳纤维将是直的且不分支的。用电子束蒸发器无法控制Ni催化剂的晶体取向。结果，会有一些纤维由于催化剂脱湿而分支9.此外，晶体取向会导致VACNF生长到不同的高度，因此很难在所有VACNF上实现均匀的高度。</li>
	<li>以 1000 rpm 的速度将一层光刻胶 （SPR955） 旋涂在纤维上 45 秒。然后使用切割锯将 1/4 晶圆切成 3 mm x 3 mm 阵列。此时将光纤存放以备后用。 注意：如果计划将纤维转移到柔性基板上，请不要执行步骤 1.11。</li>
</ol>2. 将VACNF 转接到柔性基板上（图 7 和图 8）
<ol><li>合成纤维后，将SU-8 2015光刻胶以4000rpm的速度旋涂到晶圆或四分之一晶圆上45秒。</li>
	<li>将晶圆在95°C下软烘烤3分钟。</li>
	<li>使用接触对准器，用 3 mm 3 mm 阵列图案掩模曝光晶圆，该掩模与电子束光刻以 95 mJ/cm 2 的速度定义的图案对齐。 注意： 使用接近接触模式，曝光间隙比最高光纤大 20 μm。在此过程中的这一步中，纤维可能会被打翻。</li>
	<li>在95°C下进行曝光后烘烤6分钟。</li>
	<li>将晶圆在SU-8显影剂中显影15秒，用IPA冲洗，然后用N2干燥晶圆，从上到下移动。 注意： 显影晶圆时，请确保其完全浸没。</li>
	<li>在3000rpm下旋转涂覆带有薄光刻胶保护层（SPR 955 CM 0.7）的旋涂图案晶圆45秒，并在90°C下软烘烤30秒。</li>
	<li>通过将薄氧化硅层沉积在100°C下22个循环，将薄氧化硅层沉积到晶圆（2-3nm）上。</li>
	<li>使用切割锯将晶圆切割成 3 毫米 x 3 毫米的正方形。将切割锯对准晶圆上预先存在的图案。</li>
	<li>使用SEM以30°倾斜评估所得纤维的几何形状，加速电位为3 kV。</li>
	<li>如果存放芯片以供长期使用（>1 周），请在此处停止。将薯片存放在黑暗中。</li>
	<li>要将柔性基板与刚性基板分开，请将单个芯片置于丙酮中30分钟或直到SU-8开始卷曲。</li>
	<li>用IPA洗涤SU-8薄膜（附着在刚性基材上或从刚性基材上分离）5分钟，然后用水洗涤5分钟。运输时将薯片放入带有粘垫的商业盒子中。</li>
	<li>可选：将 SU-8 薄膜的无纤维面放在水溶性胶带上或薄硅橡胶上，上面有薄聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET）（12.5 μm 厚）背衬。<ol><li>使用镊子转移SU-8薄膜。按压 SU-8 正方形的边缘，使其粘在胶带/硅橡胶-PET 上;这是为了避免断裂光纤。此时，VACNF薄膜已准备好立即使用。</li>
		<li>要准备硅橡胶/PET 支架，请执行以下操作：使用两部分硅橡胶套件，将两部分（弹性体和交联剂）混合在一起。接下来，切出一个正方形的PET并将其粘在一个透明的塑料盘中。在PET顶部倒入一层非常薄的硅橡胶，并在80°C下固化1-2小时。</li>
	</ol></li>
</ol>3.在工厂使用纤维在刚性基材中使用溶液的方法（将一滴溶液放置在植物表面）（图1A）
<ol><li>使用前用丙酮（100%，5分钟），IPA（100%，5分钟）和ddH2O（5分钟）的增量洗涤去除光刻胶。</li>
	<li>将要刺穿的植物组织放在坚硬的表面上作为支撑。</li>
	<li>将 1 μL 染料或 DNA 液滴 （200 ng） 放在植物组织表面。</li>
	<li>将带有刚性基板的 VACNF 芯片放置在液滴顶部，纤维的方向使它们与液滴接触。 注意： 芯片的方向可以通过晶圆的“光泽度”来确定。芯片的闪亮面有纤维，不透明的一面没有。</li>
	<li>使用镊子的扁平面，敲击芯片。使用软头记号笔标记芯片接触的植物区域。交货后取出 VACNF 芯片。 注意： 敲击时施加的力的大小会因所使用的植物组织类型而异。建议在进行纤维穿刺之前练习攻丝。避免损伤植物组织。当人们可以在植物组织中看到VACNF芯片的轮廓时，损伤是显而易见的。</li>
	<li>对照重复步骤3.1-3.5（+染料/DNA，-纤维;-染料/DNA，+纤维;和-染料/DNA，-纤维）。-纤维是芯片的无纤维面。</li>
	<li>如果需要，将完整的植物或切除的植物器官储存在潮湿的室内，在长时间的条件下（16小时光照，8小时黑暗）。对于切除的器官，使用塑料培养皿和湿纸巾。</li>
</ol>4. 片上方法（将一滴溶液放在VACNF芯片上），刚性基板（图1B）
<ol><li>使用前用丙酮（100%，5分钟），IPA（100%，5分钟）和ddH2O（5分钟）的增量洗涤去除光刻胶。</li>
	<li>将 1 μL 染料或质粒 DNA （200 ng） 滴入具有刚性基板的 VACNF 芯片的纤维侧。确保将液滴放在芯片的中心并覆盖几根纤维。让液滴干燥15分钟。 注意： 芯片的方向可以通过晶圆的“光泽度”来确定。芯片的闪亮面有纤维，不透明的一面没有。</li>
	<li>处理叶子或其他切除器官时，将它们放在坚硬的表面上。使用完整的植物时，在应用VACNF的器官下方放置一个坚硬的表面。</li>
	<li>在15分钟的干燥步骤之后，放置VACNF芯片，使纤维侧与植物组织接触。用镊子的后端敲击芯片。 注意： 敲击时施加的力的大小会因所使用的植物组织类型而异。建议练习敲击芯片。</li>
	<li>重复工厂方法的步骤 3.6-3.7。</li>
</ol>5. 使用片上方法将 SU-8 薄膜中的 VACNF 应用于植物组织（图 1C）
<ol><li>将 1 μL 染料或 DNA 液滴 （200 ng） 放在 SU-8 薄膜的纤维侧，并使其干燥 10 分钟。确保将液滴放在芯片的中心。 注意： 根据所使用的基材，干燥时间会有所不同。</li>
	<li>使用一把锋利的镊子，将VACNF薄膜放在植物表面。 注意：SU-8 胶片在空气中放置的时间越长，胶片就越脆。为限制丢失 SU-8 胶片的风险，请确保所有工厂/样品和设备都靠近 SU-8 胶片。</li>
	<li>轻轻地将一个小化妆器卷在 VACNF 薄膜上。用软头记号笔标记放置柔性基材的区域。使用胶带从植物表面去除柔性基质。 注意： 滚动化妆涂抹器时施加的力的大小会因使用的植物组织而异。在进行生物分子或染料递送之前练习应用 VACNF 薄膜。当人们可以看到植物组织中VACNF薄膜的轮廓时，对植物组织的可见损伤是显而易见的。</li>
	<li>对照重复步骤5.1-5.3，并按照工厂方法的步骤3.7所述储存植物。</li>
</ol>6. 所有输送方式的显微镜和图像分析
<ol><li>使用共聚焦显微镜对样品进行成像，使用适合输送的荧光探针/报告基因的发射和激发波长。 注意：瞬时转化所需的时间因植物种类和传递的标记物而异。例如，在拟南芥中48小时后检测到荧光标记物的表达，而在生菜叶中则在96小时后检测到荧光标记物的表达7。</li>
	<li>成像时，尽量聚焦在纤维脱落的区域。纤维将具有不同的方向。输送的成功与否并不取决于断裂纤维的外观。 注意：由于 PECVD18 中纤维形成导致氮化硅层的形成，纤维将具有最常见的激发/发射设置。</li>
	<li>每个样本至少捕获 5 张图像。产生的信号会有所不同。</li>
	<li>使用 ImageJ19 测量 20 μm x 20 μm 共聚焦图像区域7 中的荧光值作为总荧光（积分密度）。</li>
</ol>

使用碳纳米纤维阵列将生物分子和染料高效递送到植物中

<ol>
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作者没有什么可透露的。

在本文中，我们提出了构建垂直排列的碳纳米纤维阵列的方法，将纤维转移到柔性基质上，并将纤维在刚性或柔性基质中应用于植物，用于将生物分子或染料递送给植物。我们描述了两种通用方法，即片上方法和工厂上方法，用于沉积引入的材料，并展示了在刚性基板上的纤维以及使用VACNF薄膜的片上方法的成功结果。这些纤维的应用在实践和理论上比传统的植物转化方法（粒子轰击、通过PEG或电穿孔的原生质体转化）更简单，可用于对农杆菌介导的转化不敏感的植物。然而，只有少数细胞被转化。
垂直排列的碳纳米纤维是在橡树岭国家实验室纳米相材料科学中心通过其用户程序生产的。用户可以申请使用该设施生产VACNF。或者，VACNF芯片可以在洁净室中使用带有碳源的直流等离子体增强化学气相沉积机生产22,23。使用所描述的方法，有几个步骤对于纤维的生产、纤维转移和 VACNF 芯片/薄膜的应用至关重要。要使纤维应用起作用，纤维必须是直的，并且在尖端具有 <200 nm 的锥形直径才能成功输送到植物细胞中 6,7（图 3）。为了制造特定尺寸和间距的碳纳米纤维，可以改变多种参数，包括网点大小、横向间距和沉积的催化剂量。为了选择用于碳纳米纤维生产的最佳网点尺寸，从各种网点尺寸生长纤维（如图5所示）。我们发现直径为 300 nm 的光纤效果最好，因此选择了这种网点尺寸（图 5）。在找到正确的参数后，我们希望使用具有 >50% 光纤且具有理想几何形状（直且尖端直径 <200 nm）的芯片。为了检查纤维的几何形状，我们使用扫描电子显微镜对VACNF芯片/薄膜样品的随机视场进行成像。
此外，纤维必须具有一定的最小长度才能在植物细胞内实现输送。生产不同长度纤维的重要性在于，可以使用更长的纤维来穿透更深的组织层。较长的纤维（长度>40 μm）对于柔性薄膜至关重要，因为纤维转印的工作原理是将纤维从其基部折断，并且需要在纤维顶部分层SU-8。用于该协议的SU-8层的工作厚度为20-35μm。在各种植物（弯曲或扁平）的表皮内完成输送所需的最小高度为 10-15 μm 6,7。因此，长度为 >40 μm 的纤维是 VACNF 薄膜所必需的。在生产碳纳米纤维时，需要考虑几个不同的参数：催化剂材料、催化剂几何形状、催化剂材料的厚度以及PECVD腔内的条件（气体比、压力、温度、电流、喷淋头高度和生长时间）8,9,24,25。为了生产Morgan等7和Davern等6使用的长度超过25 μm的碳纳米纤维，我们增加了Ni催化剂的用量，改变了乙炔氨的比例，并增加了电流和生长时间。此外，我们更加关注催化剂材料的几何形状。为了产生高大的直纤维，沉积的催化剂需要具有曲棍球形状，而不是类似于火山的形状（图4）。火山结构是由升空后光刻胶的残余物产生的。为了防止火山的形成，在电子束光刻过程中使用双层PMMA来形成底切26。底切有助于沉积金属催化剂的剥离（图2）。催化剂的厚层对于高VACNFs的生长很重要。Merkulova等人24研究了VACNFs的形态。VACNF的垂直排列是由于Ni催化剂尖端型生长和垂直于衬底的直流电位排列（图6）。喷淋头描述了PECVD反应器的几何形状（图6），并作为电场电位的来源27。
为了用电子束光刻技术定义催化剂点阵列，我们应用了电子束光刻胶（聚甲基丙烯酸甲酯），然后使用电子束在光刻胶上以特定形状和特定位置在光刻胶上打小孔。将所需直径的孔放置在具有定义间距（间距）的规则网格上，并在将基板加载到机器之前将指定所需图案的文件加载到电子束光刻工具中。除了纤维高度外，纤维转移成功的另一个关键参数是在丙酮浴中花费的时间。VACNF薄膜需要在丙酮浴中放置足够长的时间，以使其边缘开始卷曲;如果它们在丙酮浴中放置的时间太短，它们就更难从芯片上取下，并且可能会破裂。芯片越老，它们在丙酮浴中停留的时间就越长。在丙酮浴之后，将薄膜/芯片置于异丙醇和水中以除去接触丙酮并去除纤维上的保护性光刻胶。
为了进行旋涂，将晶圆或晶圆片放置在旋涂机的真空吸盘上，并使用旋涂机的测试功能验证晶圆的中心位置。将光刻胶的小水坑（直径~2.5 cm）施加到晶圆的中心并纺丝（3000 rpm，持续45秒） 图8中包括纺涂前后的纤维图像，显示了纤维几何形状（高度、方向和间距）的保存情况。纤维的存在会导致光刻胶在纤维底部涌出，并导致层比预期的更厚。VACNF生长后的旋涂已被其他组探索11,18。
该工艺中另一个至关重要的步骤是确保对VACNF芯片/薄膜施加适量的力。输送机制依赖于纤维通过镊子在刚性基质 6,7 上敲击的冲击力或在柔性基质上使用迷你化妆涂抹器滚动在细胞壁上进行小穿刺。纤维可能会也可能不会断裂并保持嵌入植物细胞6,7 而不会影响结果，但结合检查染料吸收和组织损伤的练习对于获得正确的压力是必要的。此外，在使用 VACNF 芯片/薄膜递送 DNA 后选择适当的成像时间点也很重要，因为可检测表达的时间因植物物种和递送载体类型而异7（图 16）。
尽管这种方法广泛适用于植物，但它有一些局限性。例如，在VACNF薄膜中添加一层薄薄的氧化硅并不总是导致薄膜完全亲水，因为在SU-8的顶部添加了光刻胶保护层。如果这个问题成为现实，则可以将更厚的氧化硅层应用于VACNF。为了测试薄膜是疏水的还是亲水的，可以将它们放入水中。如果薄膜下沉，它们是亲水的，如果它们漂浮，它们是疏水的。此外，生产的纤维批次之间可能存在差异。在直流-PECVD机器中生长光纤时，有几个参数可以改变;该协议中描述的是两种不同量的Ni催化剂的一组参数。此外，Ni催化剂的晶体取向无法控制28 ，一些支化将不可避免地导致纤维的产生。
虽然我们在本文中展示了使用刚性和柔性底物将荧光素染料和 DNA 递送至植物细胞，但该方法应广泛适用于其他生物分子和基因修饰方法，例如，用于苹果或其他水果等植物系统的 RNAi 沉默，在这些系统中，产生稳定的转基因系需要数年时间。此外，这些纤维还可用于递送遗传编辑材料或用于植物的稳定转化。

植物转化（瞬时和稳定）尚未在所有植物组织和物种中广泛实现。植物的瞬时转化是质粒中编码的基因暂时导入植物但不能稳定地掺入基因组的过程。使用颗粒轰击、农杆菌、电穿孔或聚乙二醇处理原生质体的传统方法速度慢或可能很麻烦。此外，它们并不适用于所有植物物种1、2、3、4。使用纳米材料进行 DNA 递送是一个新兴领域，仍处于起步阶段5.纳米材料，特别是碳纳米纤维，也已成功用于将蛋白质、葡聚糖和染料输送到植物叶子，而不会引起伤口反应6。这项工作的目标是提供一种详细的协议，用于使用一种纳米材料，即碳纳米纤维，将生物分子或染料输送到植物。在这里，我们专注于DNA作为首选的生物分子，它允许各种植物器官中的细胞瞬时转化。
此前，Morgan等人7 展示了使用附着在刚性硅衬底上的碳纳米纤维来瞬时转化生菜， 本氏猪笼草 和杨树的叶子，以及拟南芥的叶子和根。尽管在各种器官上都取得了成功的转化，但纤维更难应用于具有弯曲表面的植物组织，例如根或果实。我们推断，纳米纤维的柔性背衬可能会通过更好地符合器官的形状来提高其输送效率。
在此，我们详细介绍了用于制造和设计垂直排列的碳纳米纤维、将 VACNF 转移到柔性基质以及将 VACNF 应用于植物的刚性和柔性基质以递送生物分子和染料的方法。采用直流催化等离子体增强化学气相沉积（dc C-PECVD）和Ni催化剂制备了碳纳米纤维。如Melechko等人所述，使用电子束光刻、金属蒸发和剥离过程的组合来控制Ni催化剂点的位置、直径和高度8,9。使用双层电子束光刻胶，可以在基底上沉积较厚的镍催化剂，以产生更长的纤维10。纤维从刚性基板到柔性基板的转移基于对Fletcher等人11中描述的方法的修改，目前的方法放弃了使用无定形碳层或牺牲光刻胶层。SU-8 通过纤维转移的升空是通过利用 SU-812,13,14 烘烤不足和曝光不足产生的固有拉伸应力来实现的。SU-8 是一种复杂的聚合物，具有天然疏水性，这使得其难以用于促进 DNA 递送。为了抵消SU-8的疏水性，我们在纤维嵌入SU-8后，通过原子层沉积15施加一层薄薄的氧化硅。在刚性基材上应用纤维进行生物分子/染料递送利用了 Davern 等人 6 中描述的镊子攻丝的冲击力以及 Morgan 等人 7 中描述的植物上和芯片上方法。柔性VACNF薄膜通过首先将薄膜上的DNA或染料液滴半干燥，如Morgan等人7的芯片方法，然后使用小型化妆涂抹器16,17在弯曲的植物表面上滚动薄膜，将柔性VACNF薄膜应用于弯曲的植物表面。图 1 描述了将刚性和柔性基材中的纤维应用于植物的各种方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

将生物分子和不透水染料输送到完整的植物中是一项重大挑战。纳米材料是将DNA递送至植物的新兴工具。尽管这些新工具令人兴奋，但它们尚未得到广泛应用。在刚性基材（背衬）上制造的纳米材料特别难以成功应用于弯曲的植物结构。本研究描述了微加工垂直排列的碳纳米纤维阵列并将其从刚性基板转移到柔性基板的过程。我们详细介绍并演示了这些纤维（在刚性或柔性基材上）如何用于瞬时转化或染料（例如荧光素）递送至植物。我们展示了如何将 VACNF 从刚性硅衬底转移到柔性 SU-8 环氧树脂衬底以形成柔性 VACNF 阵列。为了克服SU-8的疏水性，柔性薄膜中的纤维涂有一层薄薄的氧化硅层（2-3nm）。为了将这些纤维输送到弯曲的植物器官，我们将 1 μL 染料或 DNA 溶液液滴沉积在 VACNF 薄膜的纤维侧，等待 10 分钟，将薄膜放在植物器官上，并使用滚动运动的拭子将纤维驱动到植物细胞中。通过这种方法，我们已经在具有曲面的植物器官中实现了染料和DNA的递送。

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

作者聚焦：通过使用碳纳米纤维阵列进行创新来解锁工厂转型 

在刚性或柔性基材上使用垂直排列的碳纳米纤维阵列，将生物分子和染料输送到植物

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

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在这里，我们描述了微加工垂直取向碳纳米纤维 （VACNF）、将 VACNF 转移到柔性基材上以及将 VACNF 应用于植物的刚性和柔性基材以进行生物分子和染料递送的方法。

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

我们正试图展示一种使用碳纳米纤维阵列将染料或DNA递送到植物中的通用方法。许多植物对传统的转化方法很顽固。我们的方法可以在柔性刚性基板上使用碳纳米纤维阵列来解决这个问题。我们的技术快速且用户友好。它几乎可以应用于任何植物物种或植物器官。它还可用于递送其他试剂，如染料和蛋白质。

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

924 次观看.  The University of Chicago. 我们正试图展示一种使用碳纳米纤维阵列将染料或DNA递送到植物中的通用方法。许多植物对传统的转化方法很顽固。我们的方法可以在柔性刚性基板上使用碳纳米纤维阵列来解决这个问题。我们的技术快速且用户友好。它几乎可以应用于任何植物物种或植物器官。它还可用于递送其他试剂，如染料和蛋白质。

视频: 作者聚焦：通过使用碳纳米纤维阵列进行创新来解锁工厂转型 

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

科研

生物工程

On-Chip Method to Deliver Dye or Biomolecules to Plants Using VACNFs in a Flexible Substrate

Begin by preparing vertically aligned carbon nano fibers, or VACNFs. To transfer the VACNFs to a flexible substrate, first place the individual chips in acetone to separate the flexible substrate from the rigid substrate. Then, wash SU-8 films with IPA for five minutes, followed by washing with water for five minutes.Place the chips in a commercial box with a sticky pad when transporting them. Prepare a silicone rubber PET holder by mixing the elaststomer and the crosslinker from a two-part kit. Cut out a square of PET and tape it down in a clear plastic dish.Then, pour a very thin film of silicone rubber on top of the PET and cure it at 80 degrees Celsius for one to two hours. Transfer the SU-8 film to the PET holder using a pair of tweezers, and place the fiberless side of the SU-8 film on the silicone rubber. Press on the edges of the SU-8 square to help it stick to the silicone rubber PET and avoid breaking off fibers.Then, place a one microliter droplet of dye onto the fiber side of the SU-8 film and let it dry for 10 minutes. After drying, place the VACNF film onto the plant surface using a pair of sharp tweezers. Then, gently roll a small makeup applicator over the VACNF film.Mark the areas where the flexible substrates are placed with a soft tipped marker. Then remove the flexible substrates from the plant surface using tape. Repeat VACNF application for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film.The on-chip method was used to deliver fluorescein dye to curved surfaces, such as strawberries, in which a strong fluorescein signal was observed immediately. Whereas in apples, a strong fluorescein signal was seen after two hours of delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in apples.Also, a successful transient transformation of onions was done by delivering the plasmid containing yellow fluorescent protein using VACNF films.

在柔性基质中使用VACNF将染料或生物分子输送到植物的片上方法

On-Plant Method to Deliver Dye or Biomolecules Using VACNFs in a Rigid Substrate

To begin, remove the photo resist from the VACNFs by washing with 100%acetone for five minutes, followed by a five minute wash with 100%IPA, and then double distilled water for five minutes. Then, place the plant tissue to be impaled on a hard surface for support. Place a one microliter droplet of dye onto the surface of the plant tissue.Place a VACNF chip with a rigid substrate down the top of the droplet, with the fibers oriented such that they will come into contact with the droplet. Using the flat side of a pair of tweezers, tap the chip, mark the area of the plant that the chip came into contact with using a soft tipped marker. Remove the VACNF chips after delivery.Repeat these steps for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film. Store intact plants or excised plant organs in humid chambers in long day conditions. For excised organs, use a plastic Petri dish with wet paper towels.Using this method, fluorescein dye was delivered to Arabidopsis leaves. Images taken at different time points, showed that the fluorescein dye was observed immediately after delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in Arabidopsis leaves.