作者感谢蒂鲁瓦拉 Pushpagiri 研究中心主任兼负责人 Mathew Mazhavancheril 博士在记录研究中心的程序方面提供的支持。

此处概述的协议符合机构人类研究伦理委员会（IRB，Pushpagiri 研究中心，喀拉拉邦）的指导方针。拔牙的使用遵循道德标准进行，以确保参与者的完整性、尊严和权利。本研究选择的参与者是 30 岁以下需要拔牙进行正畸治疗的健康个体。那些患有广泛龋齿或严重牙周炎的人被排除在研究之外。从需要拔除保留牙的儿童中收集乳牙。还获得了参与本研究的受试者的知情书面同意书。
1. 牙齿的拔除和运输
<ol><li>乳牙和恒牙的收集<ol><li>向参与者解释手术的目的以及拔出的牙齿可能用于研究目的。</li>
		<li>在局部麻醉下通过在要拔牙的牙齿附近施用麻醉剂进行拔牙。具体来说，在本研究中，以 1：200,000 的比例注射 1.75 mL 利多卡因与肾上腺素（参见材料表）的混合物。最好选择没有表现出严重龋齿或牙周炎的牙齿20,21.</li>
	</ol></li>
	<li>拔牙的运输 注意：建议在无菌条件下工作以避免污染。这包括佩戴个人防护设备，例如手套和实验服，以及在无菌环境中工作，例如生物危害层流罩。<ol><li>拔牙后，用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液冲洗，以去除血液和其他碎屑。使用无菌镊子和手术刀，小心地从牙齿表面去除任何附着的软组织残留物（图 2A）。</li>
		<li>将牙齿浸入消毒剂溶液（如 70% 乙醇）中 10 秒。消毒后，用无菌 PBS 冲洗牙齿，以洗去任何残留的消毒剂。</li>
		<li>将牙齿放入含有运输介质的无菌容器中。 注：运输培养基由 Alpha-MEM 组成，这是一种补充有抗生素的商业培养基：100 U/mL 青霉素/链霉素（参见 材料表）。这种培养基为拔出的牙齿内的细胞提供必需的营养物质，确保它们在实验室处理前存活。抗生素用于抑制细菌生长。</li>
		<li>在运输过程中保持 4 °C 的温度以减缓细胞代谢活动并延迟细胞死亡。将牙齿运送到实验室进行下一步，包括处理和分离牙髓干细胞。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 牙髓组织的收集
<ol><li>使用牙科镊子固定牙齿，以确保它在手术过程中保持在原位。使用金刚石盘在连接到水冷却剂的牙科手机（参见 材料表）中切割牙齿（图 2B）。 注意：目标是暴露牙髓室，而不会对内部的牙髓组织造成不必要的伤害。</li>
	<li>使用牙科挖掘机（见 材料表）去除牙髓组织。该仪器可以在不造成损坏的情况下提取牙髓，从而保持牙髓干细胞的活力（图 2C）。</li>
	<li>将获得的组织放在玻璃培养皿上。用磷酸盐缓冲盐水清洗牙髓组织。</li>
</ol>3. 牙髓组织的消化和细胞分离
<ol><li>组织切碎和消化<ol><li>用无菌手术刀片小心地将牙髓组织切碎成小碎片（图 2D），并将其放入含有 PBS 的微型组织研磨机中，以获得精细均质的混合物。这个过程增加了组织的表面积，促进了消化过程中更有效的酶作用。</li>
		<li>将切碎的均质组织片段转移到 15 mL 试管中，并使用 3 mg/mL I 型胶原酶和 4 mg/mL 分散酶的混合物进行酶消化（参见 材料表）。将这些酶溶解在 Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 中以达到所需浓度。</li>
		<li>将牙髓组织在酶混合物中孵育（步骤3.1.2）在37°C下孵育约2小时。 孵育后，中和酶，并通过离心（步骤 3.2.1）收集细胞以进行进一步培养。</li>
	</ol></li>
	<li>离心和重悬<ol><li>孵育后，将消化的组织转移到 15 mL 离心管中，并在室温下以 300 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。此步骤将细胞与剩余的未消化的组织片段和酶分离。小心丢弃上清液培养基，确保不会干扰试管底部的细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。该培养基为分离的细胞生存和增殖提供了必要的营养和环境。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 细胞培养
<ol><li>细胞的铺板和孵育<ol><li>小心地将重悬的细胞转移到 25 cm² 培养瓶中。 注：将来自单个牙髓的所有材料转移到单个 25 cm2 细胞培养瓶中。5-7 mL 的培养基体积可确保细胞有足够的覆盖率和营养可用性。确保 DPSC 的培养基是 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），补充有 10%-20% 胎牛血清 （FBS）（见 材料表），以提供必要的生长因子。此外，在培养基中补充 1% 青霉素/链霉素，以防止细菌污染。确保细胞均匀分布在整个培养瓶中，以促进均匀生长。</li>
		<li>将培养瓶在 37 °C 下在含有 5% CO2 的环境中孵育。</li>
	</ol></li>
	<li>介质更换和监测汇合度<ol><li>每 2-3 天更换一次培养基，以提供新鲜的营养物质并去除代谢废物。为此，请使用无菌血清移液管小心吸出旧培养基，并用新鲜培养基替换。</li>
		<li>定期在显微镜下监测细胞培养物，以跟踪细胞的生长并检查是否有任何污染迹象。</li>
		<li>继续此过程，直到细胞达到 80%-90% 汇合，此时细胞覆盖大部分培养瓶表面积，但不会过于拥挤。</li>
	</ol></li>
	<li>细胞胰蛋白酶消化和传代或冷冻<ol><li>一旦细胞达到 80%-90% 汇合度，去除培养基并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞，以去除残留培养基和非贴壁细胞。</li>
		<li>向培养瓶中加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，以将细胞从培养瓶表面分离。在 37 °C 下孵育 2-5 分钟，直到细胞脱落。</li>
		<li>通过添加等体积的培养基来中和胰蛋白酶，然后轻轻上下移液细胞悬液以确保细胞完全分离。</li>
		<li>在室温下以 300 x g 离心细胞悬液 5 分钟以沉淀细胞。</li>
		<li>将细胞重悬于新鲜培养基中，然后重新铺板（传代）以进一步生长或冷冻以备将来使用。冻存时，使用含有冷冻保护剂（如 DMSO）的冻存培养基，以保护细胞在冻存过程中免受损伤。</li>
	</ol></li>
</ol>5. DPSCs 的表征
<ol><li>流式细胞术分析<ol><li>为了确认分离细胞的间充质干细胞性质，进行流式细胞术分析22,23。最初，按照步骤 4.3 中的说明胰蛋白酶消化并收集细胞。</li>
		<li>通过台盼染料排除技术确定细胞活力。在第 2 次和第 8 次传代期间使用细胞活力分析仪（参见材料表）进行分析。在第 3 次和第 7次传代期间通过流式细胞仪进行表型分析。</li>
		<li>孵育后，在流式细胞术缓冲液中洗涤细胞以去除多余的抗体，并使用流式细胞仪分析细胞。 注：流式细胞术缓冲液由磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS）、1%-2% 胎牛血清 （FBS） 和 0.1% 叠氮化钠 （NaN3） 组成。FBS 或 BSA 阻断抗体的非特异性结合，而叠氮化钠起到防腐剂的作用。高比例的细胞应表达间充质干细胞标志物，而缺乏造血标志物，从而证实它们作为 DPSCs 的身份24。</li>
		<li>分离 DPSC 并用免疫荧光抗体染色以进行流式细胞术分析。 注：用于间充质干细胞 （MSC） 流式细胞术分析的标志物的选择基于国际细胞治疗学会 （ISCT） 建立的共识，该共识指出 MSC 应表达 CD105、CD73 和 CD90，并且缺乏 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a 或 CD19 的表达，以及 HLA II 类25。这些标记物通常用于调查牙髓干细胞的研究26。用于染色的抗体浓度可能因所使用的特定抗体而异，建议按照制造商的说明（参见 材料表）了解抗体稀释度和孵育条件25。</li>
		<li>为上述 CD 标志物的表达建立分类标准27,28：小于 10%，无表达;在 11% 到 40% 之间，低表达;范围为 41%-70%，中等表达;高于 71%，高表达。</li>
		<li>此外，通过将单独的细胞等分试样与抗 CD34 和 CD45 的抗体一起孵育来确认不存在造血标志物。</li>
	</ol></li>
</ol>6. 多谱系分化
注意：以下步骤概述了牙科干细胞成骨、成脂和成软骨分化的方案。首先，将培养物以每孔 1 x 105 个细胞的密度接种在含有完全培养基 （CM） 的纤连蛋白包被的组织培养板中。在开始所需的分化方案之前，监测细胞生长直至达到 80%-90% 汇合。为了评估 DPSC 的多系分化潜力，通过将细胞接种到 24 孔板中并在适当的分化培养基中培养它们，启动向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化过程。
<ol><li>成骨分化<ol><li>通过在标准条件下在常规生长培养基中培养 DPSC 来启动，直到它们达到 70%-80% 汇合。</li>
		<li>从细胞中取出生长培养基，然后用 1x PBS 洗涤细胞一次。将成骨分化培养基 （ODM） 添加到细胞中。 注：ODM 由补充有 10% FBS、100 单位/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、0.25 μg/mL 两性霉素 B、50 μg/mL 抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸酯和 100 nM 地塞米松的 Alpha 最低必需培养基 （α-MEM） 组成（参见 材料表）。</li>
		<li>将细胞在 37 °C 和 5% CO2 的成骨培养基中孵育。每 2-3 天更换一次成骨培养基。 注意：14 到 21 天后，DPSC 应该已经分化成成骨细胞样细胞。这可以通过检查成骨细胞特异性标志物（如碱性磷酸酶）的表达增加，或使用染色技术检测矿化基质（如茜素红 S 染色）来确认。</li>
		<li>通过在-20°C下用70%冰冷的乙醇孵育1小时来固定细胞。</li>
		<li>在室温下，在黑暗中用 40 nM 茜素红 S （pH 4.2） 染色溶液对固定的细胞进行染色 10-15 分钟。在显微镜下观察染色以确认成骨分化（图 3）。通过用茜素红 S 对细胞进行染色来确认分化，茜素红 S 可识别指示矿化的钙沉积物 29,30。</li>
	</ol></li>
	<li>成脂分化<ol><li>如上一节所述，在标准条件下，在 37 °C 下 CO2 含量为 5% 的潮湿环境中培养 DPSC。 当细胞达到约 70%-80% 汇合时传代细胞。</li>
		<li>吸出培养基并用 1x PBS 洗涤细胞一次。用成脂分化培养基替换洗脱的培养基。该培养基通常由 DMEM、10% FBS、10 μg/mL 胰岛素、1 μM 地塞米松、200 μM 吲哚美辛和 0.5 mM IBMX 组成（参见 材料表）。</li>
		<li>每 3-4 天更换一次分化培养基。约 3 周后，用 PBS 洗涤产脂分化的 DPSC，并在室温下用 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定 20 分钟。</li>
		<li>用油红 O 对固定的细胞进行染色（参见材料表），以观察脂滴积累（图 4）。为了进一步确认成脂分化，对过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （PPARγ） 和脂联素31,32 等成脂标志物进行基因表达分析。</li>
	</ol></li>
	<li>软骨形成分化<ol><li>在 37 °C 下维持在 5% CO2 的潮湿气氛中的 DPSC 培养物用于软骨形成分化。当细胞达到约 70%-80% 汇合时传代细胞。</li>
		<li>吸出培养基并用 1x PBS 洗涤细胞一次。用软骨形成分化培养基替换洗脱的培养基，该培养基通常含有高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）、1% ITS、100 nM 地塞米松、50 μg/mL 抗坏血酸-2-磷酸盐、40 μg/mL 脯氨酸和 10 ng/mL 转化生长因子-β 3 （TGF-β3）（参见 材料表）。</li>
		<li>将细胞维持在软骨形成分化培养基中，每 2-3 天更换一次培养基。大约三周后，DPSC 应该已经分化成软骨细胞样细胞。</li>
		<li>通过在室温下将细胞与 4% 多聚甲醛 （PFA） 孵育 20 分钟来固定细胞。固定后，用阿尔新蓝对细胞进行染色（参见 材料表）并在显微镜下观察它们以确认软骨形成分化（图 5）。</li>
		<li>使用用于蛋白聚糖的阿尔新蓝染色或聚集蛋白聚糖、SOX9 和 II 型胶原蛋白等软骨形成标志物的基因表达分析等技术确认 DPSC 分化为软骨细胞33,34。</li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有什么可披露的。

该方案概述了从人类乳牙和恒牙中分离、培养和表征牙髓干细胞 （DPSC）。它包括对这些细胞的储存和增殖的描述， 以及它们体外 分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜力的评估35。
Chen 等人36 证明牙髓干细胞 （DPSC） 可以从各种来源获得，包括受牙周炎、牙根吸收、冠周炎和牙齿断裂等疾病影响的受感染的重...

由于干细胞研究在再生医学和组织工程方面的应用前景广阔，因此在生物医学科学中蓬勃发展。牙髓干细胞 （DPSC） 来源于人类乳牙和恒牙的牙髓组织，由于其现成的可用性和多能能力，作为干细胞的来源引起了人们的极大兴趣 1,2。正如大量研究所证实的那样，这些细胞有可能分化成各种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞3。
在过去的几十年里，干细胞的研究和治疗应用激增。干细胞的巨大潜力要求获得干细胞的来源多样化。有几个因素会影响所选细胞的效率、活力和干性。尽管存在各种已知的干细胞储存库，例如骨髓和脂肪组织，但与这些来源相关的侵入性手术、部位发病率和伦理问题通常会限制他们的探索 4,5。在各种干细胞来源中，牙科干细胞因其易于获取、高可塑性和多种潜在应用而受到关注。尤其是人类牙髓干细胞，其治疗前景已被广泛研究6。牙齿通常作为医疗废物丢弃，但含有丰富的间充质干细胞7。保护这个宝贵的干细胞库需要患者、牙医和医生的共同努力，以确保这些资源不被浪费，使每个牙髓干细胞都能满足未来的再生需求。
牙髓来源的干细胞，例如人类成人牙髓干细胞 （DPSC） 和来自剥落的人乳牙 （SHED） 的干细胞，位于牙髓的血管周围生态位中。这些细胞被认为起源于颅神经嵴细胞，并表现出间充质干细胞 （MSC） 和神经外胚层干细胞的早期标志物。DPSC 和 SHED 已证明具有多能性和再生多种组织类型的能力8。
牙科干细胞的潜在来源包括健康的乳牙和恒牙。干细胞仅占牙髓中细胞总数的 1% 左右，这凸显了有效分离和扩增技术的重要性9。因此，这些干细胞的提取和扩增是 DPSC 分离的关键步骤10。拔出或脱落的牙齿需要储存在营养丰富的运输介质中，例如磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或 Hanks 缓冲盐水溶液 （HBSS）。
可以通过多种方法获得牙髓，具体取决于牙齿类型 7,11。对于根部吸收的乳牙，可以通过根尖进行拔牙。同样，无菌倒钩拉刀可用于从根尖未成熟开放的恒牙中获取牙髓。在牙根完全发育的恒牙的情况下，进入牙髓室包括将牙冠与牙根分离。这是通过在牙骨质牙釉质交界处使用金刚石盘切割牙齿来实现的。这个切口暴露了牙髓室，从而能够取出牙髓组织 12,13,14。
牙髓干细胞 （DPSC） 可以通过酶消化 （ED） 或组织外植体 （OG） 的生长（也称为自发生长）来分离。ED 方法使用酶（主要是胶原酶 I 和分散酶）将组织分解成单细胞悬液15,16。OG 方法更简单、更快捷，需要将果肉片段切碎并直接放入培养板中，让细胞从组织外植体中生长17。研究人员利用并比较了这两种技术来评估细胞增殖速率、分离干细胞特性的保留、分化和表面标志物表达18。建立和标准化高效和干性获取 DPSCs 的方案可以为有效和安全的疗法铺平道路19。该方案包括使用酶消化、实验室处理、保存和细胞分化提取 DPSC，并通过比色染色进行脂肪生成、成骨和软骨生成。
本文中概述的方案提出了一个循序渐进的程序，从从牙齿中初步分离牙髓开始，然后在实验室中培养和维护 DPSC，最后使用特定的干细胞标志物对其进行表征（图 1）。还描述了将这些干细胞诱导成不同细胞谱系的技术，突出了它们的多能性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobuty-l-methyl-xanthine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>AS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>RM471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin Red S staining solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>GRM894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase -Staining kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium (&#945;-MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium (&#945;-MEM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>012-04802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-glycerophosphate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet-Laminar flow hood</td>
			<td>Labconco Corporation,MO 64132-2696,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, and HLA-DR</td>
			<td>BioLegend, Inc.CA 92121,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (70 &#181;m )</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCP025</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>REMI Elektrotechnik Limited (REMI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>1101 | 1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Worthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Growth Medium</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>AT006</td>
			<td>DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (15 or 50 )</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td>546021P/546041P</td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>15-350-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryolabels</td>
			<td>Label India:</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovial storage boxes&#160;</td>
			<td>Cryostore Storage Boxes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (1.8 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>PW1282</td>
			<td>Self standing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flask (25 cm&#178;)</td>
			<td>Corning Inc.NY 14831,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture flasks</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCG4/TCG6</td>
			<td>T25/T75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plates</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCP129/TCP008</td>
			<td>60 mm/100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Diamond Discs</td>
			<td>Komet SC 29730, USA</td>
			<td></td>
			<td>Komet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Spoon Excavator</td>
			<td>Brasseler,GA 31419,USA</td>
			<td>5023591U0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethosone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethosone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>D4902-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TC185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Roche Diagnostics,Mannheim,Germany.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>MB106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol -70%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td>Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extraction forceps&#160;</td>
			<td>Dentsply Sirona, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>RM9954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USA</td>
			<td>F2442-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin-coated tissue culture plate</td>
			<td>Corning Inc.Corning, NY 14831,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry buffer</td>
			<td>BD Biosciences,CA 95131,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slip 22 x 22 mm</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TCP017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Lonza Group Ltd,4002 Basel, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed dental handpiece&#160;</td>
			<td>NSK Ltd,Tokyo 8216, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Ti-Max Z series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Pfizer Inc. NY 10017,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>I5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>I5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) premix</td>
			<td>Corning Incorporated,MA 01876,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (60% )</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>MB063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine mixed with epinephrine</td>
			<td>DENTSPLY,NC 28277,USA</td>
			<td></td>
			<td>Citanest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Air Liquide,75007 Paris,France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage tank</td>
			<td>Cryo Scientific Systems Pvt. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany</td>
			<td>30020</td>
			<td>Accupipet-2-20 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini tissue grinder</td>
			<td>Bio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USA</td>
			<td></td>
			<td>ReadyPrep mini grinders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minus 80 freezer</td>
			<td>Blue Star Limited</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber</td>
			<td>Marienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil red O stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>1024190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic Differentiation Medium (ODM)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TCL119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Solution (PBS) without Ca++ and Mg++</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>TS1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA, USA</td>
			<td>P3813-1PAK</td>
			<td>1x PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade Size 15&#160;</td>
			<td>Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UK</td>
			<td>BDF-6955C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>HiMedia Laboratories&#160; Ltd.Mumbai,India</td>
			<td>AS102</td>
			<td>4% w/v solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Tarsons Products Pvt. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile container -20 mL</td>
			<td>3M Center, MN 55144-1000,USA</td>
			<td></td>
			<td>3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>P3813-1PAK</td>
			<td>1x PBS, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes (2, 5, and 10 mL )</td>
			<td>Eppendorf AG,22339 Hamburg,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes and tips</td>
			<td>Eppendorf India Limited</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade Handle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.,NJ,USA</td>
			<td>371030</td>
			<td>BP Handle 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-&#946;3)</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.MN 55413,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-&#946;3)</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc.MN 55413,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TCL046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA</td>
			<td>TCL046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td>Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA</td>
			<td>BSW-01D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and characterization of dental pulp stem cells from human deciduous and permanent teeth

在再生医学和治疗应用领域，干细胞研究正在迅速获得关注。牙髓干细胞 （DPSC） 存在于乳牙和恒牙中，由于其可及性、适应性和先天分化能力，已成为重要的干细胞来源。DPSC 提供了现成且丰富的间充质干细胞库，展示了令人印象深刻的多功能性和潜力，特别是用于再生目的。尽管它们很有希望，但主要障碍在于有效地分离和表征 DPSC，因为它们在牙髓细胞中表示为微小部分。同样重要的是妥善保存这种宝贵的细胞资源。DPSC 分离的两种主要方法是酶消化 （ED） 和组织外植体生长 （OG），通常称为自发生长。该方案主要集中在 DPSC 分离的酶消化方法上，错综复杂地详细说明了包括提取、实验室处理和细胞保存在内的步骤。除了提取和保存之外，该方案还深入研究了 DPSC 的分化能力。具体来说，它概述了用于诱导这些干细胞分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的程序，展示了它们的多能属性。随后使用比色染色技术有助于准确可视化和确认成功分化，从而验证分离的 DPSC 的口径和功能。这个全面的方案就像一个蓝图，涵盖了牙髓干细胞提取、培养、保存和表征的整个范围。它强调了 DPSC 所蕴藏的巨大潜力，推动了干细胞的探索，并为未来的再生和治疗突破带来了希望。

概述方案的成功执行产生了能够进行多系分化的牙髓干细胞 （DPSC），证明了它们的多能性。
活力检测 在不同时间点使用台盼蓝排除测定法评估 DPSCs 的活力。结果显示，在整个培养过程中始终保持高活力（大于 95%），证明了我们的分离和培养方案的稳健性。
菌落形成单位 （CFU） 检测 进行 CFU 测定以评估 DPSC 的自我更新能?...

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Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth

该方案强调通过酶消化从牙髓中提取、培养和保存多能干细胞。此外，它展示了它们分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的潜力，突出了过程中精度和一致性的重要性。

来自人类乳牙和恒牙的牙髓干细胞的分离、培养和表征

In the realm of regenerative medicine and therapeutic applications, stem cell research is rapidly gaining traction. Dental pulp stem cells (DPSCs), which ...

首先用牙科镊子将拔出的人牙固定到位。然后使用连接到牙科手机和水冷却剂的金刚石盘切割牙齿。使用牙科挖掘机，从牙齿上去除牙髓组织。接下来，使用无菌手术刀片小心地将牙髓组织切成小碎片。然后将这些片段放入含有 PBS 的微型组织研磨机中，形成均匀的混合物。将切碎的组织片段转移到 15 毫升的试管中，并使用 1 型胶原酶和分散酶的混合物消化它们。将组织在 37 摄氏度的酶混合物中孵育 2 小时。孵育后，中和酶。接下来，将消化的组织转移到 15 毫升试管中，并在室温下以 300 G 离心 5 分钟。然后小心地弃去上清液，将沉淀重新悬浮在新鲜的 DMEM 中，补充有 10% 至 20% FBS。对于细胞培养，小心地将细胞悬液转移到 25 平方厘米的培养瓶中。将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中孵育。2 到 3 天后，使用无菌血清移液管，小心吸出培养基并更换为新鲜培养基。接下来，为了表征 DPSC，打开流式细胞仪并确认分离细胞的间充质干细胞性质。DPSC 成功分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞验证了 DPSC 的多能性。DPSCs 的倍增时间与间充质干细胞报道的倍增时间一致，表明细胞群健康且增殖。流式细胞术分析显示，大多数 DPSCs 的 CD-90 、 CD-73 和 CD-105 呈阳性，证实了它们作为间充质干细胞的身份。此外，不到 2% 的细胞对 CD-34 、 CD-45 和 HLADR 呈阳性，证实不存在明显的造血或内皮细胞污染。

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Bioengineering

933 次观看.  Hamad Medical Corporation. 首先用牙科镊子将拔出的人牙固定到位。然后使用连接到牙科手机和水冷却剂的金刚石盘切割牙齿。使用牙科挖掘机，从牙齿上去除牙髓组织。接下来，使用无菌手术刀片小心地将牙髓组织切成小碎片。然后将这些片段放入含有 PBS 的微型组织研磨机中，形成均匀的混合物。将切碎的组织片段转移到 15 毫升的试管中，并使用 1 型胶原酶和分散酶的混合物消化它们。...