Comece prendendo o dente humano extraído no lugar com uma pinça dentária. Em seguida, corte o dente usando um disco de diamante conectado a uma peça de mão odontológica e um refrigerante de água. Usando uma escavadeira odontológica, remova o tecido pulpar do dente.
Em seguida, use uma lâmina cirúrgica estéril para picar cuidadosamente o tecido pulpar em pequenos fragmentos. Em seguida, coloque esses fragmentos em um mini moedor de lenços de papel com PBS para formar uma mistura homogênea. Transferir os fragmentos de tecido picados para um tubo de 15 mililitros e digeri-los utilizando uma mistura de colagenase tipo um e dispase.
Incube o tecido na mistura enzimática a 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, neutralize as enzimas. Em seguida, transfira o tecido digerido para um tubo de 15 mililitros e gire a 300 G por cinco minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, descarte cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em DMEM fresco, complementado com 10 a 20% de FBS. Para a cultura de células, transferir cuidadosamente a suspensão celular para um balão de cultura de 25 centímetros quadrados. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.
Após dois a três dias, usando uma pipeta sorológica estéril, aspire cuidadosamente o meio e substitua-o por um meio novo. Em seguida, para a caracterização das DPSCs, ligue o citômetro de fluxo e confirme a natureza das células-tronco mesenquimais das células isoladas. A diferenciação bem-sucedida de DPSCs em osteoblastos, adipócitos e condrócitos valida a natureza multipotente das DPSCs.
O tempo de duplicação das DPSCs foi consistente com o relatado para células-tronco mesenquimais, sugerindo uma população de células saudáveis e proliferativas. A análise por citometria de fluxo mostrou que a maioria das DPSCs foi positiva para CD-90, CD-73 e CD-105, confirmando sua identidade como células-tronco mesenquimais. Além disso, menos de 2% das células foram positivas para CD-34, CD-45 e HLADR, confirmando a ausência de contaminação significativa de células hematopoiéticas ou endoteliais.
