Inizia fissando il dente umano estratto in posizione con una pinza dentale. Quindi tagliare il dente utilizzando un disco diamantato collegato a un manipolo dentale e un refrigerante ad acqua. Utilizzando un escavatore dentale, rimuovere il tessuto pulpare dal dente.
Successivamente, utilizzare una lama chirurgica sterile per tritare accuratamente il tessuto pulpare in piccoli frammenti. Quindi posizionare questi frammenti in un mini tritacarte con PBS per formare una miscela omogenea. Trasferire i frammenti di tessuto tritati in una provetta da 15 millilitri e digerirli utilizzando una miscela di collagenasi di tipo uno e dispasi.
Incubare il tessuto nella miscela enzimatica a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, neutralizzare gli enzimi. Quindi, trasferire il fazzoletto digerito in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 300 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi scartare con cura il surnatante e risospendere il pellet in DMEM fresco, integrato con il 10-20% di FBS. Per la coltura cellulare, trasferire con cura la sospensione cellulare in un pallone di coltura di 25 centimetri quadrati. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%.
Dopo due o tre giorni, utilizzando una pipetta sierologica sterile, aspirare con cura il terreno e sostituirlo con un terreno nuovo. Successivamente, per la caratterizzazione delle DPSC, accendere il citometro a flusso e confermare la natura delle cellule staminali mesenchimali delle cellule isolate. Il successo della differenziazione delle DPSC in osteoblasti, adipociti e condrociti convalida la natura multipotente delle DPSC.
Il tempo di raddoppio delle DPSC era coerente con quello riportato per le cellule staminali mesenchimali, suggerendo una popolazione cellulare sana e proliferativa. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che la maggior parte delle DPSC era positiva per CD-90, CD-73 e CD-105, confermando la loro identità come cellule staminali mesenchimali. Inoltre, meno del 2% delle cellule era positivo per CD-34, CD-45 e HLADR, confermando l'assenza di una significativa contaminazione delle cellule ematopoietiche o endoteliali.
