Comience asegurando el diente humano extraído en su lugar con pinzas dentales. A continuación, corte el diente con un disco de diamante conectado a una pieza de mano dental y a un refrigerante de agua. Con una excavadora dental, extraiga el tejido pulpar del diente.
A continuación, utilice una cuchilla quirúrgica estéril para picar cuidadosamente el tejido pulpar en pequeños fragmentos. A continuación, coloque estos fragmentos en un mini triturador de pañuelos con PBS para formar una mezcla homogénea. Transfiera los fragmentos de tejido picado a un tubo de 15 mililitros y digieralos usando una mezcla de colagenasa tipo uno y dispasa.
Incubar el tejido en la mezcla de enzimas a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, neutralice las enzimas. A continuación, transfiera el tejido digerido a un tubo de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, deseche con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en DMEM fresco, suplementado con un 10 a 20% de FBS. Para el cultivo celular, transfiera con cuidado la suspensión celular a un matraz de cultivo de 25 centímetros cuadrados. Incubar las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%.
Después de dos o tres días, con una pipeta serológica estéril, aspire cuidadosamente el medio y reemplácelo por un medio fresco. A continuación, para la caracterización de las DPSC, encienda el citómetro de flujo y confirme la naturaleza de las células madre mesenquimales de las células aisladas. La diferenciación exitosa de las DPSC en osteoblastos, adipocitos y condrocitos valida la naturaleza multipotente de las DPSC.
El tiempo de duplicación de las DPSC fue consistente con el reportado para las células madre mesenquimales, lo que sugiere una población de células sanas y proliferativas. El análisis de citometría de flujo mostró que la mayoría de las DPSC eran positivas para CD-90, CD-73 y CD-105, lo que confirma su identidad como células madre mesenquimales. Además, menos del 2% de las células fueron positivas para CD-34, CD-45 y HLADR, lo que confirma la ausencia de contaminación significativa de células hematopoyéticas o endoteliales.
