用于收获治疗性造血干细胞/祖细胞的体内骨类器官方法

我们长期从事生物材料的研究，引进了材料生物学家开发病毒、活性骨修复材料的开创性概念，以及生长因子、制备和活化的技术专家。我们开发了一种使用生物活性材料实现自身结节、组织和疾病治疗细胞的按需生产体内骨类器官方法。传统的干细胞个体扩增技术在维持干细胞的生理功能方面面临限制。

我们的方案构建了一个个体培养物的微环境，以确保干细胞的丰富数量，同时保留其刺激。首先，将重组人原液和未开封的明胶海绵放在无菌洁净的工作台上。使用消毒剪刀将明胶海绵切成 48 块大小均匀的小块，并将它们转移到 48 孔板中。

移液管重组人原液数次以充分混合。吸出 30 微升溶液，滴加到明胶海绵中。然后，用一层封口膜密封 48 孔板。

从洁净工作台上取下板，并将其置于零下 20 摄氏度的温度下。首先，将麻醉的鼠标转移到手术区域，并将其置于右侧卧位，以便于将生物活性支架植入左腿。使用剃须机剃掉左腿的毛发，并使用交替轮换的洗必泰和酒精对剃须区域进行消毒，每次 3 次。

切开后，将眼科剪刀沿胫骨方向插入造口袋的肌肉中，为后续材料植入提供空间。现在，取准备好的装有重组人并使用眼用镊子的生物活性支架，将其捏成圆柱形。沿着之前创建的狭缝将支架植入肌肉袋中。

植入 12 周后，麻醉小鼠并小心地将后肢与躯干分开。使用微型剪刀，小心翼翼地从骨类器官中取出肌肉组织。使用纱布去除任何附着的软组织，以确保骨类器官样品干净。

在室温下将一部分骨类器官在 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 小时，用于组织学分析。首先，从植入含有重组人骨类器官的支架的小鼠中收获骨类器官，将骨类器官放入研钵中，并加入 1 毫升 HBSS，不含钙和镁离子。用手术剪刀将样品切碎，然后在研钵和研杵中轻轻压碎。

将细胞悬液中的结果通过 40 微米细胞过滤器。然后，在 4 摄氏度下以 300 G 离心 5 分钟。之后，丢弃上清液。

将细胞沉淀重悬于 300 μL HBSS 中并充分混合以获得均匀的细胞悬液。将麻醉的亚致死照射鼠标放在设置为 37 摄氏度的加热垫上。确保完全麻醉后，将鼠标置于左侧卧位，头部朝向右侧。

使用带有 25 号针头的 1 毫升注射器，吸出 200 微升准备好的细胞悬液。要露出手术的眼睛，请将手指放在头顶和下巴上，然后轻轻地向后和向下拉动皮肤。小心地将针头以大约 30 度角插入眼睛的内眦，斜面朝下。

用针头轻轻地沿着眼球的轮廓，直到它到达眼睛底部。将细胞悬液平稳缓慢地注入指定区域。完成注射后，将鼠标放回笼子中以允许恢复。