Approccio osteo-organoide in vivo per la raccolta di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche terapeutiche

Siamo stati a lungo impegnati nella ricerca sui biomateriali, introducendo il concetto pionieristico dei biologi dei materiali sotto lo sviluppo di virus, materiali di riparazione ossea attiva e i tecnologi per il fattore di crescita, la preparazione e l'attivazione. Abbiamo sviluppato un approccio osteo-organoide in vivo utilizzando materiali bioattivi per ottenere la produzione su richiesta di autonoduli, tessuti e cellule per il trattamento della malattia. La tecnologia tradizionale dell'espansione individuale delle cellule staminali incontra limitazioni nel mantenere le funzioni fisiologiche delle cellule staminali.

Il nostro protocollo costruisce un microambiente di colture individuali per garantire un'abbondante quantità di cellule staminali preservandone lo stimolo. Per iniziare, posizionare la soluzione madre umana ricombinante e la spugna di gelatina non aperta su un banco pulito sterile. Usa le forbici sterilizzate per tagliare la spugna di gelatina in 48 pezzi di dimensioni uniformi e trasferiscili in una piastra da 48 pozzetti.

Pipettare più volte la soluzione madre umana ricombinante per mescolarla accuratamente. Aspirare 30 microlitri di soluzione e aggiungerla goccia a goccia alla spugna di gelatina. Quindi, sigillare la piastra a 48 pozzetti con uno strato di parafilm.

Togliete la piastra dal banco pulito e mettetela a una temperatura di meno 20 gradi Celsius. Per iniziare, trasferire il topo anestetizzato nell'area chirurgica e posizionarlo nella posizione sdraiata laterale destra per facilitare l'impianto dell'impalcatura bioattiva nella gamba sinistra. Utilizzando una macchina da barba, radere i peli della gamba sinistra e disinfettare la zona rasata utilizzando cicli alternati di clorexidina e alcol, tre volte ciascuno.

Dopo aver praticato l'incisione, inserire le forbici oftalmiche nel muscolo della sacca in direzione della tibia per fornire spazio per il successivo impianto del materiale. Ora, prendete l'impalcatura bioattiva preparata caricata con umano ricombinante e usando una pinza oftalmica, pizzicatela in una forma cilindrica. Impiantare l'impalcatura nella tasca muscolare lungo la fessura creata in precedenza.

Dopo 12 settimane dall'impianto, anestetizzare il topo e separare accuratamente l'arto posteriore dal tronco. Utilizzando forbici in miniatura, rimuovere meticolosamente il tessuto muscolare dagli osteoorganoidi. Eliminare i tessuti molli attaccati utilizzando una garza per garantire un campione di osteo-organoidi pulito.

Fissare una parte degli osteoorganoidi in soluzione di paraformaldeide al 4% per 24 ore a temperatura ambiente per l'analisi istologica. Per iniziare, raccogli osteo-organoidi da topi impiantati con un'impalcatura contenente osteo-organoidi umani ricombinanti Metti gli osteo-organoidi in un mortaio e aggiungi un millilitro di HBSS, senza ioni calcio e magnesio. Usa le forbici chirurgiche per tritare i campioni e poi schiacciali delicatamente in un mortaio e un pestello.

Passare il risultato in sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Quindi, centrifugare a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, scartare il surnatante.

Risospendere i pellet cellulari in 300 microlitri di HBSS e mescolare bene per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Posizionare il mouse anestetizzato irradiato in modo subletale su un termoforo impostato a 37 gradi Celsius. Dopo aver assicurato l'anestesia completa, posizionare il mouse in decubito laterale sinistro con la testa orientata a destra.

Utilizzando una siringa da un millilitro con ago calibro 25, aspirare 200 microlitri della sospensione cellulare preparata. Per esporre l'occhio per la procedura, posizionare un dito sulla parte superiore della testa e lungo la mascella e tirare delicatamente la pelle indietro e verso il basso. Inserire con cautela l'ago con lo smusso rivolto verso il basso nel canto mediale dell'occhio con un angolo di circa 30 gradi.

Delicatamente, seguire il contorno del bulbo oculare con l'ago fino a raggiungere la base dell'occhio. Iniettare la sospensione della cella in modo graduale e lento nell'area designata. Dopo aver completato l'iniezione, rimetti il topo nella sua gabbia per consentirne il recupero.