Durante mucho tiempo nos hemos dedicado a la investigación de biomateriales, introduciendo el concepto pionero de biólogos de materiales en el desarrollo de virus, materiales de reparación de huesos activos y los tecnólogos para el factor de crecimiento, la preparación y la activación. Desarrollamos un enfoque de osteo-organoide in vivo utilizando materiales bioactivos para lograr la producción bajo demanda de autonódulos, tejidos y células para el tratamiento de enfermedades. La tecnología tradicional de expansión individual de las células madre se enfrenta a limitaciones para mantener las funciones fisiológicas de las células madre.
Nuestro protocolo construye un microambiente de cultivos individuales para garantizar una cantidad abundante de células madre mientras se preserva su estímulo. Para comenzar, coloque la solución madre humana recombinante y la esponja de gelatina sin abrir en un banco limpio y estéril. Use tijeras esterilizadas para cortar la esponja de gelatina en 48 pedazos de tamaño uniforme y transfiéralos a un plato de 48 pocillos.
Pipetear la solución madre humana recombinante varias veces para mezclarla bien. Aspira 30 microlitros de la solución y añádela gota a gota a la esponja de gelatina. A continuación, selle la placa de 48 pocillos con una capa de parapelícula.
Retire la placa del banco limpio y colóquela a una temperatura de menos 20 grados centígrados. Para comenzar, transfiera el ratón anestesiado al área quirúrgica y colóquelo en la posición reclinada lateral derecha para facilitar la implantación del andamio bioactivo en la pierna izquierda. Con una máquina de afeitar, afeita el vello de la pierna izquierda y desinfecta el área afeitada con rondas alternas de clorhexidina y alcohol, tres veces cada una.
Después de realizar la incisión, inserte unas tijeras oftálmicas en el músculo de la bolsa en dirección a la tibia para proporcionar espacio para la posterior implantación del material. Ahora, tome el andamio bioactivo preparado cargado con humano recombinante y, con pinzas oftálmicas, pellizque hasta obtener una forma cilíndrica. Implante el andamio en la bolsa muscular a lo largo de la hendidura creada anteriormente.
Después de 12 semanas de la implantación, anestesiar al ratón y separar cuidadosamente la extremidad trasera del tronco. Con unas tijeras en miniatura, retire meticulosamente el tejido muscular de los osteoorganoides. Elimine los tejidos blandos adheridos con una gasa para garantizar una muestra de osteoorganoide limpia.
Fijar una porción de los osteo-organoides en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 horas a temperatura ambiente para su análisis histológico. Para empezar, recoja osteo-organoides de ratones implantados con un andamio que contenga osteo-organoides humanos recombinantes en un mortero, y agregue un mililitro de HBSS, sin iones de calcio y magnesio. Use tijeras quirúrgicas para picar las muestras y luego tritúrelas suavemente en un mortero.
Pase el resultado en suspensión celular a través de un colador celular de 40 micrómetros. A continuación, centrifugarlo a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después, desecha el sobrenadante.
Vuelva a suspender los gránulos de celda en 300 microlitros de HBSS y mezcle bien para lograr una suspensión celular uniforme. Coloque el ratón anestesiado irradiado subletalmente en una almohadilla térmica a 37 grados centígrados. Después de asegurar la anestesia completa, coloque el ratón en decúbito lateral izquierdo con la cabeza orientada hacia la derecha.
Usando una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 25, aspire 200 microlitros de la suspensión celular preparada. Para exponer el ojo para el procedimiento, coloque un dedo en la parte superior de la cabeza y a lo largo de la línea de la mandíbula, y tire suavemente de la piel hacia atrás y hacia abajo. Inserte con cuidado la aguja con el bisel hacia abajo en el canto medial del ojo en un ángulo aproximado de 30 grados.
Suavemente, siga el contorno del globo ocular con la aguja hasta que llegue a la base del ojo. Inyecte la suspensión de celdas suave y lentamente en el área designada. Después de completar la inyección, regrese el ratón a su jaula para permitir la recuperación.
