作者感谢 NIH 资金来源 （NIH R01HL146114）。

该方案已获得梅奥诊所机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号：A00003105-17-R23）。本研究中的动物是雄性和雌性 Sprague-Dawley 大鼠的混合物，年龄约为 3 个月大，体重在 200 克至 350 克之间。材料 表中列出了研究中使用的试剂和设备的详细信息。
1. 电极植入
<ol><li>准备电极<ol><li>确保上述设备可用：（1） 多股不锈钢丝，（2） 带 #11 刀片的手术刀，（3） 剪刀，4） 解剖显微镜，（5） 尺子，（6） 镊子，（7） 25 g 针，（8） 2 把钳子（至少一个带有压接区）。</li>
		<li>电极制造过程的详细信息如图 3 所示。对于成对的差分记录电极，至少重复此过程两次。</li>
		<li>首先，测量并切割 18 厘米的不锈钢丝。</li>
		<li>在距离电线一端 4 厘米处打一个基本的反手结，如图 3 所示;当导线的短边被植入并缝合到 DIAm 中时，这将用作锚点。</li>
		<li>使用手术刀和手术解剖镜，小心地剥去紧邻电线较短一侧的结附近的 2 毫米绝缘层。要非常小心，不要剪断多股线的股线。 注意： 这个非绝缘部分用作电极的导电表面。通常，如果无意中切断了三根或更多股线，信号质量会开始下降，如果是这样，则需要更换电极。</li>
		<li>接下来，从导线短边的末端剥去 ~5 毫米，然后将其插入 25 G 针的内腔中，制成缝合线状工具，用于将电极植入 DIAm。 注意：根据个人喜好，也可以使用更高规格的针头（例如，高达 28 G）。由于高规格针头的直径较细，气胸的风险可能会降低。但是，将多股导线插入针头的较小管腔也可能更加困难。</li>
		<li>为此，请从包装中取出一根 25 G 的针头，并使用两把钳子小心地将针头从尖锐的斜面端左右弯曲 ~1 厘米，直到它断裂。 注意：此过程不得匆忙;否则，剪切力会导致针腔闭合，需要重复该过程。</li>
		<li>将电线的剥皮端插入折断的 1 cm 针头的内腔中，确保针头紧邻电线的剩余绝缘部分。</li>
		<li>确保针和电线的其余短边之间没有未绝缘的部分，压接针以将其连接到电线上。</li>
		<li>接下来，用两把钳子小心地弯曲连接的针头，使其具有类似于标准手术缝合针的曲率。</li>
		<li>最后，从导线长边的末端剥去 ~5 mm（图 3）。将电极缝合到 DIAm 中后，导线的长边将被挖成隧道，以便从外部进入，以便进行 DIAm EMG 记录。</li>
		<li>重复该过程以制作第二个电极以进行差分记录。</li>
	</ol></li>
	<li>隔膜 EMG 电极放置<ol><li>手术前，对所有手术设备进行消毒或高压灭菌，包括 （1） 小动物理发器、（2） 带 #11 刀片的手术刀、（3） 手术剪刀、（4） 镊子和 （5） 微针架。</li>
		<li>获得一个干净的笼子，并提供食物、水、床上用品和环境丰富。放在加热垫上。这个笼子将用于安置手术后的动物。</li>
		<li>使用适当的消毒剂对手术区域进行消毒，并穿戴个人防护装备（磨砂膏、帽子、口罩和手术手套）。将先前制备的电极放入 70% 异丙醇池中。</li>
		<li>在手术区域放置加热垫，以在麻醉和手术期间保持大鼠的体温。用消毒过的手术巾盖住加热垫。</li>
		<li>称量大鼠并根据机构动物护理和使用指南计算适当的麻醉剂剂量。</li>
		<li>通过后肢肌肉注射氯胺酮 （80 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 或其他适当的麻醉剂（遵循机构批准的方案）麻醉大鼠。术前注射缓释丁丙诺啡 （1 mg/kg） 和卡洛芬 （5 mg/kg）。一旦动物不再对脚趾捏有反应，就继续。</li>
		<li>用剪刀将大鼠从剑突剃到大约后肢的一半。此外，剃掉大鼠的背部，因为电极会外化到动物够不到的地方（通常在肩胛骨周围）。用一块纱布清洁多余的头发。</li>
		<li>用蘸有葡萄糖酸氯己定（体积重量的 4%）的无菌纱布清洁皮肤，准备切口皮肤。</li>
		<li>将动物仰卧在消毒的加热垫上。从剑突开始，使用手术刀和干净的 #11 刀片做一个 4-5 厘米的头尾切口。这应该会暴露出下面的腹部肌肉层。</li>
		<li>沿着肌肉层的中线再切开一个切口（3-4 厘米），露出腹部内容物。注意不要切入腹部器官。</li>
		<li>确保 DIAm 的腹部（即下）表面可见，尽管动物的右侧会被肝脏遮挡。</li>
		<li>使用手术刀柄或其他钝器，向下推肝脏和其他器官，露出 DIAm 的腹部。</li>
		<li>从异丙醇池中取出电极并用无菌盐水清洗，准备电极以供使用。然后，使用微针架，将先前准备好的电极之一垂直于 DIAm 中肋区域中的肌肉纤维。肌肉纤维在 DIAm 上径向分布。 注意：直径很薄 （~2 mm），不得被刺破。相反，目标是将电极线的未绝缘部分（图 3）嵌入到 DIAm 中。</li>
		<li>使用手术显微镜小心地将电极缝合线（针端）插入 DIAm。让针的曲率将电极引导进出 DIAm 的腹部，确保导线的整个未绝缘部分完全嵌入肌肉中。</li>
		<li>小心地将针头拉过，直到导线上的结固定在 DIAm 中。确保电极丝的非绝缘部分 （2 mm） 完全位于 DIAm 内，在针头首次进入 DIAm 的位置打结。</li>
		<li>接下来，从电极丝上剪下针头并将其丢弃在锐器容器中。</li>
		<li>使用两个镊子，在缝合线 （3-0） 针离开 DIAm 的位置打一个结。为此，请在导线的短边系一个环，将环向下滑动到 DIAm 的腹表面，然后小心地将环拧紧成一个结。电极（非绝缘部分）现在应固定在其入口和出口点。</li>
		<li>剪掉电线短边的多余部分。</li>
		<li>按照步骤 1.2.14-1.2.18 在 DIAm 同一侧的另一个电极中缝合，距离第一个电极 ~3 mm。</li>
		<li>以相同的方式在对侧半膈肌中进行电极对植入。</li>
		<li>接下来，确保电极丝的较长一侧都在腹腔外，并开始缝合 （3-0） 肌肉层以闭合腹部。对于每对电极，制作一个环并将其锚定。 注意：确保在腹腔内留出 2-3 厘米的金属丝，以允许大鼠伸展而不会在 DIAm 上引起张力。</li>
		<li>用生理盐水清除多余的血液，然后以连续模式缝合 （3-0） 肌肉层以闭合腹膜。</li>
		<li>将一根 16 G 导管从大鼠的内侧背皮肤穿过开放的腹部皮肤，并将一对电极丝拉到大鼠的背部。</li>
		<li>用另一侧的第二根导管重复该过程，并将第二对电极丝拉过。</li>
		<li>用 3-0 缝合线以间断缝合模式缝合腹部皮肤。</li>
		<li>接下来，对于每对，将电极丝打成一个结并将它们缝合到位。</li>
		<li>为动物提供皮下盐水注射（每 50 克动物质量 ~1 毫升）。将动物放在加热垫上的干净笼子中恢复。 注意：剖腹手术可导致 DIAm 活性抑制35,36。在定量分析任何 EMG 测量值之前至少允许 72 小时。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 颈椎半切术
<ol><li>像以前一样准备无菌手术区域。</li>
	<li>手术前，对所有手术设备进行高压灭菌或消毒。所需设备：（1） 小动物理发器，（2） 带 #11 刀片的手术刀，（3） 手术剪刀，（4） 镊子，（5） 咬合器，（6） 牵开器，（7） 斜角解剖刀。</li>
	<li>DIAm EMG 电极植入后约 72 小时，称量大鼠并根据机构动物护理和使用指南计算适当的麻醉剂剂量。</li>
	<li>在麻醉大鼠之前，将大鼠置于 Bowman 式笼子中，并按照步骤 3.2 中的概述记录双侧 DIAm EMG。</li>
	<li>根据当地机构动物护理和使用委员会方案，通过腹膜内注射氯胺酮 （80 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （10 mg/kg） 或其他适当的麻醉剂麻醉大鼠。术前皮下注射缓释丁丙诺啡 （1 mg/kg） 和腹膜内注射卡洛芬 （5 mg/kg）。</li>
	<li>一旦动物不再对脚趾捏有反应，就继续。大约每 15 分钟捏一次脚趾检查麻醉深度。</li>
	<li>在开始手术之前，将大鼠置于俯卧位并记录麻醉大鼠的 EMG，如步骤 3.3 中所述。 注意：确保在大鼠处于相同位置的情况下进行所有记录。</li>
	<li>从脖子到耳朵左右的地方剃掉头发，一直到肩胛骨，然后用湿纱布去除。</li>
	<li>用葡萄糖酸氯己定（体积重量的 4%）清洁皮肤，并用无菌手术罩覆盖动物（上背部除外）。</li>
	<li>使用手术刀，做一个 4 厘米的头尾切口。缩回皮肤并切开肩斜方肌。然后解剖菱形肌，露出脊髓肌。 注意：肩斜方肌是中间斜方肌，其肌肉纤维大致平行于脊柱。菱形肌暴露在肩斜方肌下方的平面中，其肌纤维呈对角线延伸。</li>
	<li>将脊柱肌从 C1 缩回至 C3。 注意：脊柱肌紧邻脊柱。</li>
	<li>在 C2 处使用 rongeur 小心地进行椎板切除术，同时通过手术显微镜观察，以确保没有主要动脉或神经受损。</li>
	<li>在 C 2 处切割并缩回硬脑膜。</li>
	<li>在进行脊髓半切术时，将暴露的电极线从大鼠的背部连接到放大器。有关更多详细信息，请参阅步骤 3。</li>
	<li>在监测 DIAm EMG 时，将斜角解剖刀插入背根进入脊髓的点正下方，并按照 图 2A 所示的方式一直切到腹面的中点。 注意：如果使用电子加热垫，则可能需要在监测 EMG 时将其关闭以避免噪音。</li>
	<li>在此切片后的几秒钟内，确保损伤同侧的 eupneic DIAm EMG 活动停止，并且 cDIAm EMG 活动明显补偿性增加（图 2C）。</li>
	<li>如果 eupneic iDIAm EMG 活动持续存在，请用解剖刀进行另一次切割，如图 2C 所示。但是，不要越过中线;切向对侧很可能会导致动物死亡。</li>
	<li>缝合肌肉，然后用无菌缝合线缝合皮肤 （3-0）。</li>
	<li>为了保持水合作用，每 1 克动物质量皮下注射 50 mL 生理盐水，并将动物放入带有加热垫的干净笼子中进行恢复。监测动物从手术中恢复的过程。</li>
	<li>大约 72 小时后（C2SH 后第 3 天），根据方案步骤 3.2 记录清醒大鼠的 EMG 活性。小心不要损坏大鼠背部的缝线。</li>
	<li>接下来，再次麻醉大鼠（遵循机构批准的方案），使用比手术平面所需的更轻剂量的麻醉剂（正常剂量的 1/3 至 1/2 之间）。只要大鼠表现出完整的角膜反射并对脚趾捏有反应，就可以给予额外的剂量。</li>
	<li>按照协议步骤 3 监测 DIAm EMG 活动。 注意：将大鼠置于与用于初步评估 iDIAm EMG 活动的位置相同的位置。</li>
	<li>如果在第 3 天不存在 eupneic iDIAm EMG 活动（即与吸气 cDIAm EMG 活动同相的活动），则得出初始 C2SH 成功的结论，并包括同一只动物进行进一步分析。</li>
</ol>3. 数据采集和分析
<ol><li>常规设置和数据提取<ol><li>将前置放大器的带通滤波器设置为 100 Hz（高通）和 1000 Hz（低通）。 注意：这些滤波器设置消除了运动伪影，并显着减少了 60 Hz 噪声和 ECG 污染（峰值功率为 ~75 Hz），同时保留了肌内 DIAm EMG 信号的绝大多数频率内容。基于奈奎斯特理论，以 2000 Hz 的采样频率进行数字化，以避免混叠，并允许足够的分辨率来记录复合 EMG 中的运动单元活动。如果对低于 100 Hz 的频率范围进行专门的频率成分分析，则必须设置前置放大器滤波器设置，以确保不过滤感兴趣的频率。</li>
		<li>在计算机上的可视化软件中监测两个通道（左半膈肌和右半膈肌电图），并以适当的格式保存数据以供进一步分析。</li>
		<li>收集至少 1-2 分钟的 eupneic 录音，以获得足够的数据进行分析。</li>
		<li>确保在 3 个或更多时间点采集数据：<ol><li>在 C2SH 之前，在清醒和麻醉条件下建立基线呼吸记录。</li>
			<li>在 C2SH 手术期间，在麻醉条件下建立 eupneic iDIAm EMG 活动的沉默。</li>
			<li>在 C2SH 后第 3 天，确认不存在 eupneic iDIAm EMG 活动持续存在，并建立清醒动物缺陷程度的初始点，该程度不受脊髓休克 2,39 或丁丙诺啡等呼吸抑制剂给药的影响。</li>
		</ol></li>
		<li>使用任何允许对数字化信号进行计算的软件（例如 Matlab、Python、R）分析 DIAm EMG 记录。基本流程如下：<ol><li>加载原始 EMG 文件。根据 filtering 设置，可能需要考虑信号中的 DC 偏移。 注意：一个简单的解决方法是从自身中减去原始 EMG 信号的平均值。</li>
			<li>计算 EMG 信号的均方根，移动窗口为 50 毫秒。这可以通过一次向前移动 50 ms 的计算窗口一个采样点来完成，直到到达信号的末尾。 注意：对单个 DIAm EMG 事件的分析提供了最大的统计功效，并允许 eupneic 和非 eupneic 活动的聚类。因此，正如之前的报告40 中强调的那样，在 DIAm EMG 中检测单个呼吸的开始和偏移至关重要。</li>
		</ol></li>
		<li>通过可视化瞬时呼吸频率和突发持续时间的直方图来执行 eupneic 活动的过滤，如之前的报告41 所示。</li>
	</ol></li>
	<li>唤醒录音。<ol><li>通过将大鼠放在 Bowman 式啮齿动物笼中来执行清醒记录。圆柱形 Bowman 式笼子可容纳重达 750 g 的成年大鼠。</li>
		<li>拧下 Bowman 式笼子一侧的金属棒，轻轻地将老鼠哄入其中。重新拧上金属棒，将老鼠困在圆柱形笼子里。 注意：在继续记录之前，让大鼠适应笼子至少 30 分钟。如果可能，最好在进行任何测量之前让大鼠适应 Bowman 式笼子多天。在这个适应阶段，当大鼠在笼子里时提供零食是一种很好的做法。</li>
		<li>为了尽量减少外部视觉刺激，用纸巾或类似物体在老鼠头所在的笼子前部周围搭一个帐篷。此外，尽量减少嘈杂的噪音，并确保老鼠在各个点的身体舒适度。 注意：不适的明显迹象包括坐立不安、呼吸急促和与笼子作斗争。如果观察到这些迹象中的任何一个，则可能需要将大鼠放回家笼，并在大鼠平静时尝试记录。</li>
		<li>对于较小的大鼠 （<300 g），将填充材料（例如纸巾、棉球）插入笼子的额外空间，以阻止大鼠转动 180 度。</li>
		<li>大鼠适应后，小心地将大鼠背部引出的电线连接到前置放大器，前置放大器将模拟信号馈入模数转换器，并按照步骤 3.1 中概述的程序进行操作。</li>
	</ol></li>
	<li>麻醉录音<ol><li>每次将大鼠置于相同的位置，最好更接近地模仿清醒的大鼠姿势。</li>
		<li>将大鼠背外的电线连接到前置放大器，前置放大器将模拟信号馈入模数转换器，并按照步骤 3.1 中概述的步骤进行操作。</li>
	</ol></li>
	<li>动物恢复<ol><li>将大鼠放在空的、干净的大鼠笼中，没有垫料以供恢复。</li>
		<li>将笼子放在加热垫上。</li>
		<li>在前 3 小时内定期（<15 分钟）监测大鼠或直到大鼠开始移动。以较不规律的时间间隔（30 分钟）进行监测，直到动物再次醒来。</li>
		<li>老鼠可以走动后，将它们放在一个干净的笼子里，有床上用品，有食物和水，并丰富环境。</li>
		<li>在整个实验过程中，继续每天至少监测大鼠一次。特别注意体重/喂养能力的变化以及切口部位和缝合线的完整性。</li>
	</ol></li>
</ol>

大鼠 DIAm EMG Post-C2SH 的标准化评估以最大限度地减少变异性

作者没有需要声明的利益冲突。

C2 脊髓半切术 本文中描述的程序强调对 DIAm EMG 活动的评估，这些活动作为对 C2 脊柱病变的验证，该病变横切外侧和腹侧索，同时保留背侧索（图 2A）。拟议的手术方法有两个主要好处。首先，它保留了背侧 funiculi，它保留了大鼠的动态功能，同时仍然切断了同侧对膈运动神经元的输入。其次，通过监测 DIAm EMG，我们可以验证 C2 病变?...

美国有超过 300,000 名脊髓损伤 （SCI） 患者，其中约一半患有颈椎损伤1。这些伤害会导致重大的福祉损失，并给个人、他们的家庭和医疗保健系统带来经济压力。幸运的是，大多数 SCI 是不完整的——为加强备用途径提供了潜力1。这种神经可塑性可能允许至少恢复一些功能，包括 DIAm 活性，这对通气和非通气行为很重要。因此，促进神经可塑性是帮助 SCI2 患者的一种有前途的研究途径。
SCI 的啮齿动物模型有可能为发现改善人类健康的治疗方法做出重大贡献。用于研究神经可塑性的经典 SCI 模型之一是脊髓在 C2 （C2SH） 的单侧横断（半切），它使对侧完好无损 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。C2SH 对膈输出的影响和保留对侧通路的重要性于 100 多年前由 Porter12 首次揭示，他的开创性文章为现代呼吸神经可塑性研究奠定了基础。C2SH 模型中断了延髓中喙腹呼吸组 （rVRG） 的下降输入，该组包含负责传递呼吸节律产生输出的前运动神经元14。这些 rVRG 前运动神经元还将兴奋性神经驱动传递给膈运动神经元（图 1）。几位研究人员对 C2SH 模型10、11、15、16 采取了不同的方法，这可能部分解释了不同研究之间恢复的一些差异。简而言之，方法在保留背侧装置、进行完全半切或进行不完全中断同侧 rVRG 的下行输入的外侧部分横切方面有所不同。通常，C2SH 模型对于研究呼吸神经可塑性特别有用，因为常呼吸 iDIAm 肌电图 （EMG） 活动的自发恢复率随时间推移而发生，这可以通过几个因素来改善，包括神经营养信号传导 17,18,19,20,21.然而，在明确分类恢复之前，必须首先确定初始功能丧失（定义为 eupneic iDIAm EMG 活动的沉默）。在一些研究中没有对 C2SH 时不活动进行这种验证 3,4,6,7,11,22,23。
切除脊髓的组织学评估仅提供支配脊髓中膈运动神经元的同侧兴奋性球脊髓通路适当位置受损的证据，但组织学并不能替代生理学证据（例如，诊断肌电图）。此外，组织学评估是在终末时间点（通常在受伤后数周至数月）离体进行，因此不提供“实时”信息。一些研究人员指出，病变的大小与功能缺陷或缺乏功能缺陷的数量有关5,24,25,26。需要注意的是，这种说法的有效性可能在很大程度上取决于 “功能 ”的分类方式（即，功能任务是什么以及如何量化），而研究的差异突出了在动物之间产生功能相同的病变的困难。事实上，研究人员已经强调，损伤程度与肢体肌肉运动功能（由 Basso、Beattie 和 Bresnahan （BBB） 评分24 量化）之间的关系不是线性的27,28。在以前的研究中，我们发现 C2SH 的范围与受伤后 iDIAm EMG 活动的恢复程度之间没有关系 10,29,30,31，尽管其他研究人员报告了通气功能与白质保留程度之间的关系5。因此，在 C2SH 模型的情况下，在手术时对 iDIAm 不活动进行功能验证的方法，最好是在慢性脊髓损伤实验的时间过程早期，既有益又必要。
本文强调了使用 DIAm EMG 实时确认 C2SH 后呼吸过程中 DIAm EMG 的初始损失，以及在受伤后 3 天（第 3 天）进行的后续确认评估18、21、31、32、33。在早期使用 C2SH 模型的工作中，进行了重复剖腹手术以记录 DIAm EMG10、13、30、34。然而，最近的工作使用了慢性 EMG 电极，它允许记录麻醉和清醒大鼠的 EMG。此外，慢性电极可降低气胸的风险，并且不需要重复剖腹手术，这可能导致 DIAm35,36 的抑制。尽管许多研究人员已经使用了 C2SH 模型的版本，但在手术时尚未确认 iDIAm 活性的沉默 3,4,6,7,11,22,23。如果没有这种不活动的确认，就很难知道随后恢复的哪一部分归因于同侧和对侧通路的神经可塑性，这可能会产生不同的影响。这是一个重要的考虑因素，因为从 rVRG 到膈运动神经元的吸气神经驱动主要是同侧的，在 C2SH33 之后，大约 50% 的兴奋性谷氨酸能输入丢失到膈运动神经元。然而，来自对侧 rVRG 的剩余吸气兴奋性输入在病变部位以下，以支配同侧膈运动神经元，并且可以通过神经可塑性加强以促进功能恢复。通过去除膈运动神经元的主要同侧兴奋性输入，肾 iDIAm 肌电图活性丢失（至少在麻醉下），而 cDIAm 的活动继续甚至增强。因此，呼吸过程中 iDIAm EMG 活动的损失是衡量 C2SH 成功的指标（图 2）。
在清醒的动物中，早在 C2SH 后 1-4 天就存在一定水平的 iDIAm EMG 活动23,37。此外，在消化动物中，iDIAm 活性在上宫颈半切术后几分钟至数小时内出现，并被麻醉抑制38。此外，通过确认受伤后第 3 天麻醉大鼠呼吸期间 （eupnea） 不存在 iDIAm EMG 活动，验证了 C2SH 的成功。共聚焦成像研究证实，在损伤的初始阶段，膈运动神经元上的谷氨酸能突触输入丢失37。在受伤后第 3 天，如果有任何残留的 eupneic iDIAm EMG 活动，这被解释为同侧吸气下降驱动未完全从 rVRG 中去除的证据。本文分为三个部分：（1） 慢性 DIAm 肌电图记录，（2） C2SH 和 （3） 清醒和麻醉动物的 EMG 数据采集。该方案描述了大鼠 cSCI 的严格、可重复和可靠的 C2SH 模型，这是研究呼吸神经可塑性、代偿性 cDIAm 活性以及治疗策略和药物的绝佳平台。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25 G Needle</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>1188825100</td>
			<td>Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1&#34; (0.508 mm x 2.5 cm) A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 Vicryl Violet Braided</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J774D</td>
			<td>3-0 Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson-Brown Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11627-12</td>
			<td>Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowman Style Cage</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>POR-530</td>
			<td>Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9&#34; (228 mm); Basic unit is constructed of .5&#34; (123 mm) jeweled acrylic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td>Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated: 
			Yes, Feature: Tungsten Carbide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Lead 1m TP Shielded</td>
			<td>Biopac Systems, Inc</td>
			<td>LEAD110S</td>
			<td>Shielded lead wires for EMG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition Software</td>
			<td>LabChart</td>
			<td>LabChart 7.3.8</td>
			<td>Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software - Matlab 2023b</td>
			<td>Mathworks, Inc.</td>
			<td>Version 23.2</td>
			<td>General purpose programming language for post hoc analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10056-12</td>
			<td>Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11293-00</td>
			<td>Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromyogram Amplifier</td>
			<td>Biopac Systems, Inc</td>
			<td>EMG100C</td>
			<td>EMG amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16000-14</td>
			<td>Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td>Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated Power Supply Module</td>
			<td>Biopac Systems, Inc</td>
			<td>IPS100C</td>
			<td>Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.&#39;s MP series Data Acquisition System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13019-14</td>
			<td>Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife Curette</td>
			<td>V. Mueller</td>
			<td>VM101-4414</td>
			<td>Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Biomedical Research Instruments, Inc.</td>
			<td>11-2420</td>
			<td>Length: 4&#34;, Angle: Straight, Blade Length: 23 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistranded stainless steel wire</td>
			<td>Cooner Wire, Inc.</td>
			<td>AS 631</td>
			<td>AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 8/35</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PL3508</td>
			<td>Data acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blade #11</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle #3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley Rat</td>
			<td>Inotiv</td>
			<td>Order code: 002</td>
			<td>Sprague Dawley outbred rats (female and male)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ61</td>
			<td>Surgical microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Cutting Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co.</td>
			<td>110-1250SB</td>
			<td>Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weitlaner Retractor</td>
			<td>Codman</td>
			<td>50-5647</td>
			<td>Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional recovery of eupneic diaphragm activity following unilateral cervical spinal cord hemisection in rats

cSCI 后，DIAm 的激活可能会受到影响，具体取决于损伤的程度。本手稿描述了 cSCI 的单侧 C2 半切片 （C2SH） 模型，该模型在大鼠呼吸过程中破坏了真心同侧隔膜 （iDIAm） 肌电图 （EMG） 活动。为了评估 DIAm 运动控制的恢复，必须首先明确确定 C2SH 引起的缺陷程度。通过验证呼吸期间 iDIAm EMG 的初始完全丢失，随后的恢复可以分为不存在或存在，并且可以使用 EMG 振幅估计恢复的程度。此外，通过测量 C2SH 后急性脊髓休克期后呼吸期间呼吸期间 iDIAm EMG 活动的持续缺失，可以验证初始 C2SH 的成功。测量对侧膈肌 （cDIAm） 肌电图活动可以提供有关 C2SH 代偿作用的信息，这也反映了神经可塑性。此外，来自清醒动物的 DIAm EMG 记录可以提供有关 C2SH 后 DIAm 运动控制的重要生理信息。本文介绍了一种在大鼠中建立严格、可重复且可靠的 cSCI C2SH 模型的方法，这是研究呼吸神经可塑性、代偿性 cDIAm 活性以及治疗策略和药物的绝佳平台。

There are more than 300,000 individuals with spinal cord injury (SCI) in the United States, approximately half of whom have cervical injuries1. These injuries result in significant loss of well-being and place a financial strain on individuals, their families, and the healthcare system. Fortunately, the majority of SCIs are incomplete&#8212;providing the potential for strengthening of spared pathways1. This neuroplasticity may allow recovery of at least some function, including DIAm activity, which is important for ventilatory and non-ventilatory behaviors. Thus, promoting neuroplasticity is a promising avenue of research to help individuals with SCI2.
Rodent models of SCI have the potential to contribute substantially to the discovery of treatments to improve human health. One of the classic models of SCI used to study neuroplasticity is a unilateral transection (hemisection) of the spinal cord at C2 (C2SH), which leaves the contralateral side intact3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. The effect of C2SH on phrenic output and the importance of spared contralateral pathways was first revealed over a hundred years ago by Porter12, whose seminal article laid the foundation for modern-day studies of respiratory neuroplasticity. The C2SH model interrupts descending inputs from the rostral ventral respiratory group (rVRG) in the medulla, which contains premotor neurons responsible for transmitting the output of respiratory rhythm generation14. These rVRG premotor neurons also transmit excitatory neural drive to phrenic motor neurons (Figure 1). Several investigators have taken different approaches to the C2SH model10,11,15,16, which may partly explain some of the variability in recovery across studies. Briefly, approaches vary in terms of sparing the dorsal funiculi, performing a complete hemisection, or performing a lateral partial transection that does not completely interrupt descending inputs from the ipsilateral rVRG. Generally, C2SH models are particularly useful for studying respiratory neuroplasticity due to the rates of spontaneous recovery of eupneic iDIAm electromyographic (EMG) activity over time, which can be improved by several factors, including neurotrophic signaling17,18,19,20,21. However, an initial loss of function&#8212;defined as the silencing of eupneic iDIAm EMG activity&#8212;must be first established before recovery can be clearly classified. This validation of inactivity at the time of C2SH is not done in several studies3,4,6,7,11,22,23.
Histological assessments of the excised spinal cord only provide evidence of damage to the appropriate location of ipsilateral excitatory bulbospinal pathways innervating phrenic motor neurons in the spinal cord, but histology does not substitute for physiological evidence (e.g., DIAm EMG). Furthermore, histological assessments are performed in ex vivo at terminal time points (often several weeks to months post-injury) and thus do not provide &#34;real-time&#34; information. Some investigators have noted that the magnitude of the lesion relates to the amount of functional deficit or lack thereof5,24,25,26. It is important to note that the validity of such claims is likely highly dependent on how &#34;function&#34; is classified (i.e., what the functional tasks are and how they are quantified), and the variability across studies highlights the difficulty of producing functionally identical lesions across animals. Indeed, investigators have emphasized that the relationship between the extent of injury and limb muscle locomotor function (quantified by the Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) score24) is not linear27,28. In previous studies, we have found no relationship between the extent of the C2SH and the extent of recovery of eupneic iDIAm EMG activity post-injury10,29,30,31, although other investigators have reported a relationship between ventilatory function and the extent of white matter sparing5. Thus, in the case of the C2SH model, an approach for functional validation of iDIAm inactivity at the time of the surgery and preferably early in the time course of chronic spinal cord injury experiments is both beneficial and necessary.
The present article underscores the use of DIAm EMG for real-time confirmation of the initial loss of DIAm EMG during breathing after the C2SH as well as subsequent confirmatory assessments at 3 days (Day 3) after the injury18,21,31,32,33. In earlier work with the C2SH model, repeated laparotomies were performed to record DIAm EMG10,13,30,34. However, more recent work has used chronic EMG electrodes, which allow the recording of EMG in anesthetized and awake rats. Additionally, chronic electrodes reduce the risk of pneumothorax and don&#39;t require repeated laparotomies, which can cause inhibition of the DIAm35,36. Although versions of the C2SH model have been used by many investigators, confirmation of the silencing of iDIAm activity was not made at the time of surgery3,4,6,7,11,22,23. Without such a confirmation of inactivity, it is difficult to know what portion of subsequent recovery to attribute to the neuroplasticity of ipsilateral versus contralateral pathways, which may have differential impacts. This is an important consideration because the inspiratory neural drive from the rVRG to phrenic motoneurons is primarily ipsilateral, with a loss of about 50% of excitatory glutamatergic inputs to phrenic motor neurons after C2SH33. However, there are remaining inspiratory excitatory inputs from the contralateral rVRG that decussate below the site of the lesion to innervate ipsilateral phrenic motor neurons and can be strengthened via neuroplasticity to promote functional recovery. By removing the predominant ipsilateral excitatory input to phrenic motor neurons, eupneic iDIAm EMG activity is lost (at least under anesthesia), while the activity of the cDIAm continues and is even enhanced. The loss of iDIAm EMG activity during breathing is thus a measure of a successful C2SH (Figure 2).
Some level of iDIAm EMG activity is present as early as 1-4 days following C2SH in awake animals23,37. Additionally, in decerebrate animals, iDIAm activity is present within minutes to hours after upper cervical hemisection and is suppressed by anesthesia38. Additionally, the success of the C2SH is validated by confirming the absence of iDIAm EMG activity during breathing (eupnea) in anesthetized rats on Day 3 post-injury. Confocal imaging studies confirmed the loss of glutamatergic synaptic inputs on phrenic motor neurons during this initial stage of injury37. At Day 3 post-injury, if there is any residual eupneic iDIAm EMG activity, this is interpreted as evidence of incomplete removal of ipsilateral descending inspiratory drive from the rVRG. The present article is divided into three sections: (1) chronic DIAm EMG recordings, (2) C2SH, and (3) EMG data acquisition in awake and anesthetized animals. This protocol describes a rigorous, reproducible, and reliable C2SH model of cSCI in rats, which is an excellent platform for studying respiratory neuroplasticity, compensatory cDIAm activity, and therapeutic strategies and pharmaceuticals.

作者聚焦：大鼠颈椎半切除术后膈肌功能的神经运动控制和恢复

评估大鼠单侧颈脊髓半切除术后真膈肌活动的功能恢复

Our research focuses on neuromotor control of the diaphragm muscle during breathing. Phrenic motor neurons innervating diaphragm muscle fibers receive descending excitatory input from the brainstem, which is primarily ipsilateral and therefore disrupted by upper cervical spinal cord hemisection or C2SH. Following C2SH, there is spontaneous recovery of ipsilateral diaphragm activity reflecting neuroplasticity.A major development is demonstrating a role of brain-derived neurotropic factor or BDNF signaling through its high affinity TrkB receptor in the recovery of diaphragm activity following C2SH. A second development is the use of machine learning approaches to facilitate high throughput analyses of diaphragm activity during numerous respiratory cycles. The lack of reliable, unbiased high throughput techniques to evaluate basic elements of diaphragm neuromotor control is a challenge in defining recovery of function.This becomes especially important when you're dealing with recordings from animals that are not anesthetized. Our cervical spinal hemisection intentionally leaves the ipsilateral dorsal funiculus intact, minimizing limb muscle deficits, but still causing loss of diaphragm activity. This protocol emphasizes validation of the loss of diaphragm activity at the time of surgery, thereby establishing a clear starting point for recovery of diaphragm muscle function.Further exploring the role of BDNF TrkB signaling in neuroplasticity and recovery of diaphragm neuromotor control after cervical spinal cord injury.

本文介绍的方法通过设定明确的标准来评估 C2SH 大鼠模型中的 DIAm EMG，从而最大限度地减少操作员间的变异性。首先，必须观察 C2SH 后立即停止 eupneic iDIAm EMG 活动，如图 2 所示。如果没有，可以进行二次横断，直到 eupneic iDIAm 活性消失。其次，在 C2SH 后的第 3 天，必须在动物麻醉时验证 eupneic iDIAm EMG 的持续缺失。 图 4A 显示了...

呼吸并发症是颈脊髓损伤 （cSCI） 患者死亡的主要原因。cSCI 的动物模型对于机制评估和临床前研究至关重要。在这里，我们介绍了一种可重复的方法来评估大鼠单侧 C2 脊髓半切除术 （C2SH） 后膈肌 （DIAm） 活动的功能恢复。

Following cSCI, activation of the DIAm can be impacted depending on the extent of the injury. The present manuscript describes a unilateral C2 hemisection ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Functional Recovery of Eupneic Diaphragm Activity Following Unilateral Cervical Spinal Cord Hemisection in Rats

235 次观看.  Mayo Clinic. 我们的研究重点是呼吸过程中横膈肌的神经运动控制。支配膈肌纤维的膈运动神经元接收来自脑干的下行兴奋性输入，脑干主要是同侧，因此被上颈脊髓半切或 C2SH 破坏。C2SH 后，同侧膈肌活动自发恢复，反映神经可塑性。一项重大进展是证明脑源性嗜神经因子或 BDNF 信号通过其高亲和力 TrkB 受体在 C2SH 后隔膜活性恢复中的作用。第二项发展是?...

视频: 作者聚焦：大鼠颈椎半切除术后膈肌功能的神经运动控制和恢复

Following cSCI, activation of the DIAm can be impacted depending on the extent of the injury. The present manuscript describes a unilateral C2 hemisection (C2SH) model of cSCI that disrupts eupneic ipsilateral diaphragm (iDIAm) electromyographic (EMG) activity during breathing in rats. To evaluate recovery of DIAm motor control, the extent of deficit due to C2SH must first be clearly established. By verifying a complete initial loss of iDIAm EMG during breathing, subsequent recovery can be classified as either absent or present, and the extent of recovery can be estimated using the EMG amplitude. Additionally, by measuring the continued absence of iDIAm EMG activity during breathing after the acute spinal shock period following C2SH, the success of the initial C2SH may be validated. Measuring contralateral diaphragm (cDIAm) EMG activity can provide information about the compensatory effects of C2SH, which also reflects neuroplasticity. Moreover, DIAm EMG recordings from awake animals can provide vital physiological information about the motor control of the DIAm after C2SH. This article describes a method for a rigorous, reproducible, and reliable C2SH model of cSCI in rats, which is an excellent platform for studying respiratory neuroplasticity, compensatory cDIAm activity, and therapeutic strategies and pharmaceuticals.

Respiratory complications are the leading cause of death in individuals with cervical spinal cord injury (cSCI). Animal models of cSCI are essential for mechanistic evaluations and pre-clinical studies. Here, we introduce a reproducible method to assess functional recovery of diaphragm muscle (DIAm) activity following unilateral C2 spinal hemisection (C2SH) in rats.

科研

神经科学

Cervical Spinal Hemisection and Diaphragm Muscle Electromyographic (EMG) Monitoring in Rats

To begin, arrange the sterile surgical equipment on a surgical platform. Approximately 72 hours after the diaphragm muscle electromyographic, or EMG, electrode implantation, weigh the rat. Prior to anesthetizing the rat, place the rat in a Bowman-style cage.Carefully connect the wires, exiting the rat dorsum to a preamplifier to record bilateral diaphragm muscle EMG. Next, place the anesthetized rat in a prone position. Shave the hair from the neck at about the ear level, and down to the scapulae.Connect the exposed electrode wires from the rat's back to the amplifier. Disinfect the skin alternating with 4%chlorhexidine gluconate and isopropyl alcohol three times. Cover the rat with sterile surgical covers, except for the upper dorsum.Using a scalpel, make a four centimeter rostrocaudal incision. Retract the skin and cut the The acromiotrapezius muscle. Then dissect the rhomboid muscle to expose the spinalis muscles.Under a surgical microscope, remove the spinalis from C1 to C3.Then use rongeur to carefully perform a laminectomy at C2 without damaging major arteries or nerves. Cut and remove the dura mater at C2.While monitoring diaphragm muscle EMG, insert the angle dissecting knife just below the point where the dorsal root enters the spinal cord, and section all the way to the midpoint of the ventral surface. Then record the eupneic ipsilateral diaphragm EMG activity on the anesthetized rat with C2 spinal hemisection performed.Suture the spinal cord muscles with 3-0 sutures, and then close the skin incision. To maintain hydration, subcutaneously inject one milliliter of saline per 50 grams of animal mass. Place the rat in a clean cage with a heating pad for recovery.Set the high band-pass filter of the preamplifier to 100 hertz, and the low-pass filter to 1000 hertz. After collecting one to two minutes of left and right hemidiaphragm EMG eupneic recording, save the date in an appropriate format for further analyses. A successful example of C2 spinal hemisection showed the absence of eupneic ipsilateral diaphragm EMG activity under anesthesia on day three post-injury.Diaphragm muscle EMG activity under awake conditions showed a reduction in eupneic ipsilateral diaphragm compared to the pre-injury baseline. The contralateral diaphragm muscle EMG activity increased in both anesthetized and awake conditions.