中性粒细胞是终末分化的细胞，目前还没有细胞系来完全概括中性粒细胞生物学。因此，有必要获得纯净，灭活，健康和新鲜的嗜中性粒细胞来研究它们的生物学。这种刷新方法结合了密度梯度，沉淀，温和裂解，以获得纯中性粒细胞制剂。
它易于设置，需要简单的设备和很少的练习。这种方法的技术方面，例如渐变分层，将需要一些练习来掌握，但是一旦梯度完善，其他步骤应该变得轻而易举。首先对抛光外套、包装和层流罩进行灭菌。
然后将10毫升血液加入50毫升管中。为了稀释血液以获得更清洁的梯度，添加5%FBS / HBSS，并化妆体积高达35毫升。合上盖子后，将管倒置几次进行混合，然后将管倒置以获得底部没有红细胞。
在血液正下方加入10毫升密度梯度培养基，确保培养基和血液不混合，界面保持锋利。在室温下以400倍g旋转管子30分钟，确保禁用制动器。纺丝后，观察梯度分离成顶部血清血浆层，外周血单核细胞的中间白色环，浑浊密度梯度培养基层，以及由红细胞顶部的白色薄嗜中性粒细胞带组成的底部沉淀。
要去除PBMC，将吸液器直接放入PBMC层并完全吸出，而血清血浆层随着环的去除而减少。用吸液器刮擦管的侧面，以最大限度地去除PBMC。小心地去除PBMC环和嗜中性粒细胞/红细胞沉淀之间的混浊密度梯度培养基层。
对于红细胞沉降，使用10毫升移液管将中性粒细胞/红细胞沉淀转移到干净的管中。然后将5%FBS / HBSS加入到25毫升的最终体积中。直接将含有3%葡聚糖/ 0.9%NaCl的25毫升预热溶液加入管中，并通过倒置轻轻混合。
将管子放在水平和非振动表面上15分钟。将管子放回抽油烟机后，将移液器稍微浸入液体中，并沿着液体表面向下收集约30毫升的顶层。旋转管以获得红色颗粒，在介质中没有漂浮颗粒。
为了裂解残留的红细胞，轻轻吸出上清液而不破坏沉淀。将25毫米无菌超纯水直接加入管中，并通过倒置管28秒轻轻混合以裂解红细胞。然后，立即将25毫升在水中制备的无菌1.8%NaCl溶液加入管中，并通过温和混合将溶液带回等渗条件。
用低制动以200倍g旋转管子三到五分钟，以尽量减少红细胞和血小板与嗜中性粒细胞的沉淀。为了重悬白色中性粒细胞沉淀，直接将培养基加入沉淀上，但不要上下移液。接下来，从一侧到另一侧水平摇动管以最小化细胞活化。
如果观察到细胞聚集或聚集，则通过70微米的网格过滤细胞悬浮液以丢弃聚集的嗜中性粒细胞。为了评估分离的中性粒细胞制剂的质量，用中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和活化标记物特异性标记物染色细胞。通过流式细胞术获取20， 000个细胞后，使用门控策略分析细胞纯度和活化，并使用膜联蛋白V/碘化丙啶确定细胞活力，如文本手稿中所述。
低速的密度梯度产生纯度的中性粒细胞，而高速导致以牺牲纯度为代价的产量增加。使用荧光激活的细胞分选，单独提供细胞分布的细胞分离质量估计，但应首选使用特定的细胞标记物。鉴定出的污染细胞群是单核细胞，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。
使用该协议实现了巨大的中性粒细胞产量。评估CD62L的表达。阳性对照细胞中CD62L的平均荧光强度降低，表明CD62L脱落和中性粒细胞活化。
在进行测定之前，应评估中性粒细胞的健康状况，因为嗜中性粒细胞的半衰期相对较短，激活会进一步缩短寿命。使用密度梯度和商业微珠纯化中性粒细胞后，培养细胞24小时，并通过流式细胞术分析细胞存活率。活细胞的定量表明，密度梯度纯化在24小时后比使用试剂盒纯化产生更多的活细胞。
尽可能好地进行梯度分层和离心步骤非常重要，因为它将极大地影响制备质量。体外实验和生化测定可以在该过程后进行。此外，如果需要超纯细胞，则可以进行阴性选择，如在细胞因子和蛋白质表达实验中。
