系统生物学提供了对感染模型中生物网络和机制的见解，而合成生物学则实现了精准治疗。我们正在探索利什曼原虫重度感染中的免疫代谢以及生物合成回路解决疾病的潜力，从而彻底改变免疫治疗学。近年来，合成生物学在开发更新有效的策略来对抗利什曼病方面显示出巨大的前景。
最近的一些进展是在工程合成细胞因子、双稳态合成电路 CRISPR-Cas9 和合成肽作为治疗剂的领域。我们的方案以宿主蛋白为靶点，宿主蛋白受寄生虫调节以维持生存。因此，我们不仅研究了对寄生虫的电路的影响，还研究了对宿主的影响。
此外，我们研究了合成电路在宿主中传递时对解决正交性和模块化函数的影响。首先，在计算机上打开 TinkerCell 软件并单击零件选项卡。从库中选择 CMV 启动子组件并将其放在画布上，以符号合成电路中的巨细胞病毒启动子。
然后检索类似于四环素纵子的阻遏蛋白结合位点，并将其放置在画布上启动子附近，与 CMV 启动子整合。将内部核糖体进入位点和编码区拖放到画布上，将它们与现有的遗传成分集成。将编码区重命名为四环素反应性阻遏蛋白。
合并这些遗传元件以促进合成部分的构建。将猪 teschovirus 12A 可切割的间隔区合并到画布上。引入一个额外的编码区，琥珀酸脱氢酶或 SDHA，代表合成构建体中的目标基因，并将其与其他元素整合。
在 SDHA 编码区附近，整合另一个可被细胞蛋白酶猪 teschovirus 12A 切割的间隔区。引入代表报告基因的编码区，并将其标记为 GFP 到构建体中。在 GFP 旁边，附加一个终止符。
要验证功能性遗传回路的形成，请单击回路的任何部分。单击时，电路显示为红色。在反应选项卡中，为四环素反应性阻遏蛋白、SDHA 和 GFP 分配调节速率，以描述合成回路内的翻译反应。
从 parts （部分） 选项卡中添加一个小分子并将其命名为 doxycycline。要为多西环素分配波函数，请从 parts and connection 选项卡中选择 input（输入），然后单击 wave input（波输入）。在 reaction （反应） 选项卡中，单击 rescarion reaction（抑制反应）。
在 dox 和四环素反应阻遏物之间的画布上拖放反应速率。要设置 dox 和四环素反应阻遏物之间的反应动力学，请双击 dox 上的波函数图标并调整 doxycycline.sin。amplitude 设置为 10。
要在四环素反应性阻遏蛋白和阻遏蛋白结合位点之间实施转录调节反应，请从反应选项卡中选择反应，并将其放在四环素反应性阻遏蛋白和四环素纵子之间的画布上。双击每个组分和反应以设置初始浓度和模拟参数。单击 simulation，选择 deterministic，然后仿真 100 个时间单位的电路。
从控制面板调整模拟图，并观察 SDHA 和四环素反应性抑制蛋白的图形模式。打开标准生物部分的注册表，然后单击搜索并输入遗传成分的名称。要获得 CMV 启动子的核苷酸序列，请单击 get part 序列并将文件保存为文本文件。
要获得 SDHA 的蛋白质编码序列，请打开 NCBI 并从搜索窗口旁边的下拉列表中选择核苷酸。键入琥珀酸脱氢酶和 Mus musculus 并搜索核苷酸序列。单击 CDS 选项以获取 SDHA 的编码序列并将序列保存在文本文件中。
依次将所有遗传调控部分的核苷酸序列合并到一个文件中。在 Kozak 序列后立即添加起始密码子 ATG，并去除内部终止密码子以避免形成新生多肽。打开 Expasy 网站并粘贴核苷酸序列。
单击翻译序列选项，然后选择 5 个素数 3 个素数帧 1 并删除终止密码子。首先，在 37 摄氏度下培养 RAW264.7 细胞，直至达到 90% 汇合。准备以下样品以确定诱导合成电路的寄生虫消除作用。
从 25 平方厘米的烧瓶中刮取 RAW264.7 细胞。将细胞悬液以 300G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 1 mL DMEM 完全培养基中。将 10 微升重悬的细胞悬液转移到 100 微升试管中。
向细胞中加入 10 微升 0.5% 台盼蓝并充分混合。在细胞计数室载玻片上加载 10 μL 细胞和台盼蓝混合物，并从四个腔室中进行细胞计数。在盖玻片底部 96 孔板中以每孔 4 个细胞的幂速度接种 2 次，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育 24 小时。
要制备 6 小时的感染样品，将 1 毫升固定相主要利什曼原虫前鞭毛体在 7， 273G 下离心 10 分钟，然后将沉淀重悬于 500 μL DMEM 完全培养基中。计数后，将盖玻片底部 96 孔板中 5 个 L.major 前鞭毛体的幂次数增加 2 乘以 10。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 6 小时。
孵育后，用 PBS 洗涤细胞 3 次。为了制备 IMT 和 IMTI 样品，以 10 倍的 2 倍生长到 5 个 L.major 前鞭毛体的幂，持续 6、12、18 和 24 小时。在 1.5 mL 试管中，加入 24 μL 还原血清培养基和 1 μg 合成电路质粒。
在另一支 1.5 mL 试管中，加入 24 μL 减血清培养基和 1 μL 聚乙烯亚胺或 PEI。我通过移液至少 10 次充分混合，并在室温下孵育 5 分钟。将 PEI 混合物转移到含有 DNA 的 1.5 mL 试管中并充分混合。
将试管孵育 10 分钟。丢弃 96 孔盖玻片底板上孔中的培养基，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。使用移液管，将 DNA-PEI 混合物滴加到细胞中，轻轻摇动板。
将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 3 小时。接下来，向细胞中加入 200 μL 新鲜还原血清培养基，轻轻摇动板，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 24 小时。第二天，丢弃培养基。
用 PBS 洗涤细胞两次后，向细胞中加入含有遗传霉素和多西环素的 DMEM 完全培养基，并孵育 24 小时。合成电路的模拟揭示了 SDHA 和四环素阻遏物中的振荡动力学。将合成电路引入大肠杆菌 DH5-α 导致转化的菌落对卡那霉素表现出耐药性，表明有效转化。
随着时间的推移，用合成电路转染和用多西环素诱导显着增加了 IMT 细胞中 GFP 的表达。转染和多西环素诱导后，在感染的巨噬细胞中观察到细胞内寄生虫负荷显著降低。感染后 6 小时白细胞介素 10 和白细胞介素 12 的细胞因子水平最高，在转染和诱导合成回路时未观察到显著差异。
在 24 小时 IMTI 样本中观察到肿瘤坏死因子 α 、干扰素 γ 和转化生长因子 β 的显著增加，表明促炎细胞因子的上调。
