La biologie des systèmes offre un aperçu des réseaux et des mécanismes biologiques dans les modèles d’infection, tandis que la biologie synthétique permet une thérapie de précision. Nous explorons l’immunométabolisme de l’infection à Leishmania major et le potentiel des circuits biosynthétiques pour la résolution de la maladie, révolutionnant ainsi les immunothérapies. Au cours des dernières années, la biologie synthétique s’est révélée très prometteuse pour le développement de stratégies nouvelles et efficaces de lutte contre la leishmaniose.
Certains des développements récents concernent le domaine de l’ingénierie des cytokines synthétiques, le circuit synthétique bistable CRISPR-Cas9, et les peptides synthétiques sont à l’étude en tant que thérapies. Notre protocole cible la protéine de l’hôte, qui est modulée par le parasite pour sa survie. Ainsi, nous étudions l’effet sur le circuit non seulement sur le parasite, mais aussi sur l’hôte.
De plus, nous avons étudié l’effet du circuit synthétique sur l’orthogonalité et la fonction de modularité lors de la livraison dans l’hôte. Pour commencer, sur un ordinateur, ouvrez le logiciel TinkerCell et cliquez sur l’onglet pièces. Sélectionnez le composant promoteur CMV dans la bibliothèque et placez-le sur le canevas pour symboliser le promoteur du cytomégalovirus dans le circuit synthétique.
Ensuite, récupérez le site de liaison du répresseur analogue à l’opérateur tétracycline et positionnez-le à côté du promoteur sur la toile, en s’intégrant au promoteur CMV. Faites glisser et déposez les sites d’entrée internes du ribosome et la région codante sur le canevas, en les intégrant aux composants génétiques existants. Renommez la région codante en répresseur sensible à la tétracycline.
Fusionner ces éléments génétiques pour faciliter la construction des parties synthétiques. Incorporez sur la toile une zone d’espacement clivable par le teschovirus porcin 12A. Introduire une région codante supplémentaire, la succinate déshydrogénase ou SDHA, représentant le gène d’intérêt dans la construction synthétique et l’intégrant aux autres éléments.
Adjacente à la région codante SDHA, intégrer une autre région d’espacement clivable par la protéase cellulaire du teschovirus porcin 12A. Introduisez une région codante représentant le gène rapporteur et étiquetez-la comme GFP dans le construit. À côté de GFP, ajoutez un terminateur.
Pour vérifier la formation d’un circuit génétique fonctionnel, cliquez sur n’importe quelle partie du circuit. Le circuit apparaît rouge au clic. À partir de l’onglet réaction, attribuez des taux régulateurs au répresseur sensible à la tétracycline, au SDHA et à la GFP pour délimiter la réaction de traduction dans le circuit synthétique.
Ajoutez une petite molécule de l’onglet des pièces et nommez-la doxycycline. Pour attribuer une fonction d’onde à la doxycycline, dans l’onglet Pièces et connexions, sélectionnez entrée, puis cliquez sur entrée d’onde. Depuis l’onglet réaction, cliquez sur réaction de répression.
Glissez-déposez la vitesse de réaction sur le canevas entre le répresseur sensible au dox et le répresseur sensible à la tétracycline. Pour définir la cinétique de réaction entre le répresseur réactif dox et le répresseur réactif à la tétracycline, double-cliquez sur l’icône de fonction d’onde sur dox et ajustez doxycycline.sin. amplitude à 10.
Pour mettre en œuvre la réaction régulatrice transcriptionnelle entre la protéine répressive sensible à la tétracycline et le site de liaison du répresseur, sélectionnez la réaction dans l’onglet de réaction et placez-la sur le canevas entre le répresseur sensible à la tétracycline et l’opérateur tétracycline. Double-cliquez sur chaque composant et chaque réaction pour définir une concentration et un paramètre initiaux pour la simulation. Cliquez sur simulation, choisissez déterministe et simulez le circuit pour 100 unités de temps.
Ajustez le graphique de simulation à partir du panneau de configuration et observez le modèle graphique pour les protéines répressives sensibles à la SDHA et à la tétracycline. Ouvrez le registre des parties biologiques standard, puis cliquez sur rechercher et entrez le nom du composant génétique. Pour obtenir la séquence nucléotidique du promoteur CMV, cliquez sur obtenir la séquence de pièces et enregistrez le fichier en tant que fichier texte.
Pour obtenir la séquence codante pour la protéine SDHA, ouvrez NCBI et choisissez nucléotide dans la liste déroulante à côté de la fenêtre de recherche. Tapez la succinate déshydrogénase et Mus musculus et recherchez la séquence nucléotidique. Cliquez sur l’option CDS pour obtenir la séquence de codage de SDHA et enregistrer la séquence dans un fichier texte.
Fusionnez séquentiellement la séquence nucléotidique de toutes les parties régulatrices génétiques dans un seul fichier. Ajoutez un codon de départ ATG juste après la séquence de Kozak et supprimez les codons d’arrêt internes pour éviter la formation de polypeptides naissants. Ouvrez le site Web d’Expasy et collez la séquence de nucléotides.
Cliquez sur l’option de traduction de la séquence, puis sélectionnez cinq images premières trois images premières une et supprimez les codons d’arrêt. Pour commencer, cultivez les cellules RAW264.7 à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la confluence de 90 % soit atteinte. Préparez les échantillons suivants pour déterminer l’effet antiparasitaire du circuit synthétique induit.
Grattez les cellules RAW264.7 d’une fiole de 25 centimètres carrés. Centrifugez la suspension cellulaire à 300G pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet DMEM. Transférez 10 microlitres de suspension cellulaire remise en suspension dans un tube de 100 microlitres.
Ajoutez 10 microlitres de bleu de trypan à 0,5 % dans les cellules et mélangez bien. Chargez 10 microlitres de mélange de cellules et de bleu trypan sur la lame de la chambre de comptage de cellules et comptez les cellules de quatre chambres. Plaquez deux fois 10 à la puissance quatre cellules par puits dans une plaque de 96 puits et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Pour préparer un échantillon infecté de six heures, centrifugez un millilitre de promastigotes Leishmania major en phase stationnaire à 7, 273G pendant 10 minutes et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de milieu complet DMEM. Après avoir compté, ajoutez deux fois 10 à la puissance de cinq promastigotes de L. major dans une plaque de 96 puits à fond de lamelle. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures.
Après l’incubation, lavez les cellules trois fois avec du PBS. Pour préparer les échantillons IMT et IMTI, cultivez deux fois 10 à la puissance cinq promastigotes L. major pendant 6, 12, 18 et 24 heures. Dans un tube de 1,5 millilitre, ajoutez 24 microlitres de milieu sérique réduit et un microgramme de plasmide de circuit synthétique.
Dans un autre tube de 1,5 millilitre, ajoutez 24 microlitres de milieu sérique réduit et un microlitre de polyéthylénimine ou PEI. Je mélange bien en pipetant au moins 10 fois et j’incube à température ambiante pendant cinq minutes. Transférez le mélange PEI dans le tube de 1,5 millilitre contenant l’ADN et mélangez bien.
Incuber le tube pendant 10 minutes. Jetez le milieu des puits sur la plaque inférieure de la glissière de couverture à 96 puits et lavez les cellules trois fois avec du PBS. À l’aide d’une pipette, ajoutez goutte à goutte le mélange ADN-PEI dans les cellules et secouez doucement la plaque.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de sérum frais réduit aux cellules, secouez doucement la plaque et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, jetez le milieu.
Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBS, ajoutez des milieux complets DMEM contenant de la généticine et de la doxycycline aux cellules et incubez pendant 24 heures. La simulation du circuit synthétique a révélé une dynamique oscillatoire à la fois dans le SDHA et le répresseur de tétracycline. L’introduction du circuit synthétique dans Escherichia coli DH5-alpha a entraîné la transformation des colonies présentant une résistance à la kanamycine, ce qui indique une transformation efficace.
La transfection avec le circuit synthétique et l’induction avec la doxycycline ont significativement augmenté l’expression de la GFP dans les cellules IMT au fil du temps. Après la transfection et l’induction de la doxycycline, une réduction significative de la charge parasitaire intracellulaire a été observée dans les macrophages infectés. Les taux de cytokines de l’interleukine 10 et de l’interleukine 12 étaient les plus élevés six heures après l’infection, sans différence significative observée lors de la transfection et de l’induction des circuits synthétiques.
Une augmentation significative du facteur de nécrose tumorale alpha, de l’interféron gamma et du facteur de croissance transformant bêta a été observée dans l’échantillon IMTI de 24 heures, indiquant la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires.
