تقدم بيولوجيا الأنظمة نظرة ثاقبة للشبكات البيولوجية والآلية في نماذج العدوى ، بينما تتيح البيولوجيا التركيبية العلاج الدقيق. نحن نستكشف التمثيل الغذائي المناعي في عدوى الليشمانيا الكبرى وإمكانات دوائر التخليق الحيوي لحل المرض ، وإحداث ثورة في العلاجات المناعية. في السنوات الأخيرة ، أظهرت البيولوجيا التركيبية وعدا كبيرا تجاه تطوير استراتيجيات أحدث وفعالة لمكافحة داء الليشمانيات.
بعض التطورات الأخيرة في مجال هندسة السيتوكينات الاصطناعية ، والدائرة الاصطناعية ثنائية الثبات CRISPR-Cas9 ، والببتيدات الاصطناعية يتم التحقيق فيها كعلاجات. يستهدف بروتوكولنا البروتين المضيف ، الذي يتم تعديله بواسطة الطفيلي من أجل بقائه. وهكذا ندرس التأثير على الدائرة ليس فقط على الطفيلي ، ولكن أيضا على المضيف.
علاوة على ذلك ، درسنا تأثير الدائرة التركيبية على معالجة التعامد ووظيفة النمطية عند التسليم في المضيف. للبدء ، على جهاز كمبيوتر ، افتح برنامج TinkerCell وانقر فوق علامة التبويب الأجزاء. حدد مكون محفز CMV من المكتبة وضعه على اللوحة القماشية ليرمز إلى محفز الفيروس المضخم للخلايا داخل الدائرة الاصطناعية.
ثم استرجع موقع ربط المثبط المماثل لمشغل التتراسيكلين وضعه بجوار المحفز على القماش ، مع التكامل مع مروج CMV. قم بسحب وإسقاط مواقع دخول الريبوسوم الداخلية ومنطقة الترميز على اللوحة القماشية ، ودمجها مع المكونات الجينية الموجودة. أعد تسمية منطقة الترميز باسم مثبط مستجيب للتتراسيكلين.
ادمج هذه العناصر الجينية لتسهيل بناء الأجزاء الاصطناعية. قم بدمج منطقة فاصلة قابلة للانقسام بواسطة فيروس teschovirus 12A على القماش. إدخال منطقة ترميز إضافية ، نازعة هيدروجين السكسينات أو SDHA ، تمثل الجين محل الاهتمام في البناء الاصطناعي ودمجها مع العناصر الأخرى.
بجوار منطقة ترميز SDHA ، قم بدمج منطقة فاصل أخرى قابلة للانقسام بواسطة فيروس تساءلة الخنازير البروتياز الخلوي 12A. أدخل منطقة ترميز تمثل جين المراسل وقم بتسميته على أنه GFP في البناء. بجانب GFP، قم بإلحاق أداة إنهاء الرسومات.
للتحقق من تكوين دائرة وراثية وظيفية ، انقر فوق أي جزء من الدائرة. تظهر الدائرة باللون الأحمر عند النقر. من علامة تبويب التفاعل ، قم بتعيين معدلات تنظيمية للمثبط المستجيب للتتراسيكلين ، SDHA ، و GFP لتحديد تفاعل الترجمة داخل الدائرة الاصطناعية.
أضف جزيئا صغيرا من علامة تبويب الأجزاء وأطلق عليه اسم دوكسيسيكلين. لتعيين دالة موجية إلى دوكسيسيكلين ، من علامة تبويب الأجزاء والاتصال ، حدد الإدخال ، وانقر فوق إدخال الموجة. من علامة تبويب رد الفعل، انقر فوق تفاعل القمع.
قم بسحب وإسقاط معدل التفاعل على القماش بين المثبط المستجيب للتتراسيكلين والمضاد للدوكس. لتعيين حركية التفاعل بين المثبط المستجيب dox والتتراسيكلين ، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز دالة الموجة على dox واضبط doxycycline.sin. السعة إلى 10.
لتنفيذ التفاعل التنظيمي النسخي بين بروتين المثبط المستجيب للتتراسيكلين وموقع ربط المثبط ، حدد التفاعل من علامة تبويب التفاعل وضعه على اللوحة القماشية بين المثبط المستجيب للتتراسيكلين ومشغل التتراسيكلين. انقر نقرا مزدوجا فوق كل مكون ورد فعل لتعيين تركيز ومعلمة أولية للمحاكاة. انقر فوق المحاكاة ، واختر الحتمية ، وقم بمحاكاة الدائرة ل 100 وحدة زمنية.
اضبط الرسم البياني للمحاكاة من لوحة التحكم ولاحظ نمط الرسم البياني ل SDHA والبروتينات القمعية المستجيبة للتتراسيكلين. افتح سجل الأجزاء البيولوجية القياسية ، ثم انقر فوق بحث وأدخل اسم المكون الجيني. للحصول على تسلسل النيوكليوتيدات لمروج CMV ، انقر فوق الحصول على تسلسل الجزء واحفظ الملف كملف نصي.
للحصول على تسلسل ترميز البروتين ل SDHA ، افتح NCBI واختر النيوكليوتيدات من القائمة المنسدلة بجوار نافذة البحث. اكتب نازعة هيدروجين السكسينات و Mus musculus وابحث عن تسلسل النيوكليوتيدات. انقر فوق خيار CDS للحصول على تسلسل ترميز SDHA وحفظ التسلسل في ملف نصي.
دمج تسلسل النيوكليوتيدات لجميع الأجزاء التنظيمية الجينية بالتتابع في ملف واحد. أضف كودون بداية ATG مباشرة بعد تسلسل Kozak وقم بإزالة أكواد التوقف الداخلية لتجنب تكوين عديد الببتيدات الناشئة. افتح موقع Expasy والصق تسلسل النيوكليوتيدات.
انقر فوق خيار ترجمة التسلسل ، ثم حدد خمسة إطارات أولية ثلاثية وواحدة وقم بإزالة أكواد التوقف. للبدء ، قم بزراعة خلايا RAW264.7 عند 37 درجة مئوية حتى يتم تحقيق التقاء 90٪. قم بإعداد العينات التالية لتحديد تأثير القضاء على الطفيليات للدائرة الاصطناعية المستحثة.
اكشط خلايا RAW264.7 من قارورة مساحتها 25 سم مربع. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300G لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسط DMEM الكامل. انقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية المعاد تعليقها إلى أنبوب سعة 100 ميكرولتر.
أضف 10 ميكرولترات من 0.5٪ تريبان بلو إلى الخلايا واخلطها جيدا. قم بتحميل 10 ميكرولترات من الخلية ومزيج التريبان الأزرق على شريحة غرفة عد الخلايا وأخذ عدد الخلايا من أربع غرف. صفيحة مرتين في 10 إلى قوة أربع خلايا لكل بئر في غطاء الصفيحة السفلية ذات 96 البئر وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
لتحضير عينة مصابة لمدة ست ساعات ، قم بجهاز طرد مركزي واحد من المرحلة الثابتة من الليشمانيا البروماستيجوت الرئيسي عند 7 ، 273 جم لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من وسط DMEM الكامل. بعد العد ، أضف ضعفين في 10 إلى قوة خمسة من L.major promastigotes في لوحة 96 بئر أسفل الغطاء. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات.
بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. لتحضير عينات IMT و IMTI ، تنمو مرتين في 10 إلى قوة خمسة بروماستيجوت L.major لمدة 6 و 12 و 18 و 24 ساعة. في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 24 ميكرولترا من وسط المصل المختزل وميكروغرام واحد من بلازميد الدائرة الاصطناعية.
في أنبوب آخر 1.5 ملليلتر ، أضف 24 ميكرولتر من متوسط المصل المخفض وميكرولتر واحد من بولي إيثيلينيميني أو جزيرة الأمير إدوارد. أخلط جيدا عن طريق سحب العينات 10 مرات على الأقل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. انقل مزيج PEI إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على الحمض النووي واخلطه جيدا.
احتضن الأنبوب لمدة 10 دقائق. تخلص من الوسائط من الآبار الموجودة على اللوحة السفلية ذات الغطاء المكون من 96 بئرا واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. باستخدام ماصة ، أضف مزيج الحمض النووي وPEI بالتنقيط إلى الخلايا ورج الطبق برفق.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من وسط المصل الطازج المخفض إلى الخلايا ، ورج الطبق برفق ، واحتضنه لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، تخلص من الوسيط.
بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS ، أضف وسائط DMEM الكاملة التي تحتوي على جينتيسين ودوكسيسيكلين إلى الخلايا واحتضانها لمدة 24 ساعة. كشفت محاكاة الدائرة الاصطناعية عن ديناميكيات تذبذبية في كل من SDHA ومثبط التتراسيكلين. أدى إدخال الدائرة الاصطناعية إلى الإشريكية القولونية DH5-alpha إلى ظهور مستعمرات محولة مقاومة للكاناميسين ، مما يدل على التحول الفعال.
أدى التعدي بالدائرة التركيبية والحث باستخدام الدوكسيسيكلين إلى زيادة تعبير GFP بشكل كبير في خلايا IMT بمرور الوقت. بعد التعدي وتحريض الدوكسيسيكلين ، لوحظ انخفاض كبير في حمل الطفيليات داخل الخلايا في البلاعم المصابة. كانت مستويات السيتوكين في الإنترلوكين 10 والإنترلوكين 12 أعلى في ست ساعات بعد الإصابة ، مع عدم ملاحظة فرق كبير عند تعدي وتحريض الدوائر الاصطناعية.
لوحظت زيادة كبيرة في عامل نخر الورم ألفا ، وإنترفيرون جاما ، وتحويل عامل النمو بيتا في عينة IMTI على مدار 24 ساعة ، مما يشير إلى زيادة تنظيم السيتوكينات المؤيدة للالتهابات.
