用于转化免疫肿瘤学(I-O)研究的人类外周血单核细胞(PBMC)的人工化异种移植模型

我们的协议可以作为建立小鼠模型的一般指南，重建与人类PBMC和肿瘤免疫肿瘤学研究。这些程序提供了一种经济高效且高度可重复的方法，通过皮下和将人类PBMC与癌症异种移植物混合，部分重组人类肿瘤小鼠的人体免疫力。与我一起演示手术的将是崔欣欣、张燕菊、白惠晨和杨小龙，他们从药理科送来。

对于骨髓细胞耗竭内腹膜内交付100毫克每公斤环磷酰胺和口头交付125毫克每公斤二硫化素到6至8周大的NOD/SCID雌性小鼠每天一次，为期两天。在第二剂环磷酰胺和硫化剂24小时后，重新注射6个新鲜分离的人类PBMC中的5倍10和6个人类肿瘤细胞系细胞中的2.5倍和200微升PBS加50%的PBS，每个动物将整个体积皮下注射到每个实验动物的右侧。每周测量和记录原发性肿瘤体积两次，为期四到六周。

当肿瘤达到平均体积200至500毫米的立方体，使用光剪刀收获整个肿瘤从每个动物。PBMC供方肿瘤细胞系和患者衍生的异种移植，导致中度肿瘤生长与相对较高的PD-1，PD-L1和CD8表达应用于后续分析。对于收获的肿瘤组织的免疫组织化学分析，在脱水和将组织嵌入石蜡之前24至72小时固定样品和形式。

在聚硅素涂层幻灯片上获取三微米内嵌组织，用三次七分钟二甲苯浸入将样品脱酸。第三次治疗后，用三分钟分级酒精浸入水合。然后用去压水冲洗幻灯片三次，然后从滑梯中去除多余的液体。

要执行抗原检索，请将幻灯片放在容器中，用 10 毫摩尔高二酸化缓冲液盖住幻灯片。将滑梯、容器在微波炉中加热三分钟，然后将滑梯放在 95 摄氏度的水浴中加热 30 分钟。冷却至室温后，用去压水冲洗幻灯片三次，从滑梯中吸入多余的液体。

用0.3%过氧化氢孵育10分钟，以阻止内源性过氧化物酶活性，然后用3%BSA和PBS进行一小时的阻断。在过氧化氢孵育结束时，在四摄氏度的温度下标记幻灯片，并贴上适当的原抗体。第二天早上，用马萝卜过氧化物酶结合二次抗体在室温下治疗一小时，然后将基板滴到幻灯片上，直到通过光显微镜观察到适当水平的棕色染色。

接下来，用赤氧林染色样品。一分钟后，停止与蒸馏水的反应，然后在0.5%盐酸醇中下潜5秒，在0.5%氨水中吸收5秒。然后用三升三分钟乙醇和三、五分钟二甲苯浸入使样品脱水。

要评估感兴趣的候选药物的抗肿瘤活性，在细胞接种当天根据计划的实验方案开始治疗，并每周两次监测原发性肿瘤体积，为期四至六周。对于Proncode动态分析肿瘤渗透免疫细胞，将肿瘤组织切碎成小块，用1型胶原蛋白和DNase I和RPMI-1640介质加5%FBS消化片段，在37摄氏度下30分钟。在消化结束时，通过40微米细胞过滤器过滤消化的组织，以获得单个细胞悬浮液，并通过离心收集细胞。

每毫升冰冷传真缓冲液浓度的1倍10的7细胞将颗粒重新填充，并转移等量的细胞到96孔圆形底板中适当数量的孔。通过离心收集细胞，并在人类 IGG 每毫升 20 微克中重新给颗粒 30 分钟，以阻止任何非特异性结合。然后，在4摄氏度下用适当的原抗体染色细胞30分钟，然后根据标准方案通过流式细胞分析进行分析。

如证明，每公斤环磷酰胺100毫克，每千克125毫克解硫磷酰胺导致中性粒细胞和单核细胞在治疗后四天大量枯竭。人体PBMC和肿瘤移植后，通过免疫组织化学在肿瘤微环境内验证人体免疫细胞渗透的存在。可以对PBMC捐赠者小组进行体内筛查，以确认在可接受的肿瘤生长速率下，有相对较高的免疫细胞渗入肿瘤微环境。

也可以评估不同癌症类型患者衍生异种移植体内的人类癌细胞系，以评估肿瘤生长速率和免疫细胞渗透。在这个具有代表性的实验中，用人化抗PD1抗体对PBMC和移植人化小鼠进行人工化小鼠的治疗产生了显著的抗肿瘤活动。二硫化素可降低环磷酰胺的尿毒毒性，这种组合可能在小鼠中产生更持久的中性粒细胞减少效应。

环磷酰胺和二硫化硫化物的确切剂量方案可能需要预先确定。较新的免疫缺陷小鼠菌株，以更容易的人体免疫重组和减少异源GvHD效应已经建立，并正在等待进一步的研究，我们的文件协议。我们的模型可用于评估T细胞参与癌症免疫疗法，特别是当工作时间短或选择代理之前移动到更复杂的多线免疫模型。