Sistem biyolojisi, enfeksiyon modellerindeki biyolojik ağlar ve mekanizmalar hakkında bilgi verirken, sentetik biyoloji hassas terapiyi mümkün kılar. Leishmania majör enfeksiyonunda immünometabolizmayı ve immünoterapötiklerde devrim yaratarak hastalık çözümü için biyosentetik devrelerin potansiyelini araştırıyoruz. Son yıllarda, sentetik biyoloji, Leishmaniasis ile mücadele için daha yeni ve etkili stratejilerin geliştirilmesine yönelik büyük umut vaat etmektedir.
Son gelişmelerden bazıları mühendislik alanında sentetik sitokinler, iki durumlu sentetik devre CRISPR-Cas9 ve sentetik peptitler terapötik olarak araştırılmaktadır. Protokolümüz, hayatta kalması için parazit tarafından modüle edilen konakçı proteini hedefler. Bu nedenle, devre üzerindeki etkiyi sadece parazit üzerinde değil, aynı zamanda konakçı üzerinde de inceliyoruz.
Ayrıca, sentetik devrenin konakta teslim edildikten sonra ortogonallik ve modülerlik fonksiyonunun ele alınması üzerindeki etkisini inceledik. Başlamak için, bir bilgisayarda TinkerCell yazılımını açın ve parçalar sekmesine tıklayın. Kitaplıktan CMV promotör bileşenini seçin ve sentetik devre içindeki sitomegalovirüs promotörünü sembolize etmek için tuval üzerine yerleştirin.
Ardından, tetrasiklin operatörüne benzer baskılayıcı bağlanma bölgesini alın ve CMV promotörü ile entegre olarak tuval üzerindeki promotörün yanına yerleştirin. İç ribozom giriş bölgelerini ve kodlama bölgesini tuval üzerine sürükleyip bırakın ve bunları mevcut genetik bileşenlerle entegre edin. Kodlama bölgesini tetrasikline duyarlı baskılayıcı olarak yeniden adlandırın.
Sentetik parçaların yapımını kolaylaştırmak için bu genetik elementleri birleştirin. Tuval üzerine domuz teschovirus 12A ile kesilebilen bir ara bölge ekleyin. Sentetik yapıda ilgilenilen geni temsil eden ve onu diğer elementlerle entegre eden ek bir kodlama bölgesi, süksinat dehidrojenaz veya SDHA'yı tanıtın.
SDHA kodlama bölgesine bitişik, hücresel proteaz domuz teskovirüsü 12A ile bölünebilen başka bir ara bölgeyi entegre edin. Raportör geni temsil eden bir kodlama bölgesi tanıtın ve bunu yapıya GFP olarak etiketleyin. GFP'nin yanına bir sonlandırıcı ekleyin.
İşlevsel bir genetik devrenin oluşumunu doğrulamak için, devrenin herhangi bir parçasına tıklayın. Tıklandığında devre kırmızı görünür. Reaksiyon sekmesinden, sentetik devre içindeki translasyon reaksiyonunu tanımlamak için tetrasikline duyarlı baskılayıcıya, SDHA'ya ve GFP'ye düzenleyici oranlar atayın.
Parçalar sekmesinden küçük bir molekül ekleyin ve buna doksisiklin adını verin. Doksisikline bir dalga fonksiyonu atamak için, parçalar ve bağlantı sekmesinden girişi seçin ve dalga girişine tıklayın. Reaksiyon sekmesinden, bastırma reaksiyonuna tıklayın.
Reaksiyon hızını tuval üzerinde dox ve tetrasikline duyarlı baskılayıcı arasında sürükleyip bırakın. Dox ve tetrasiklin duyarlı baskılayıcı arasındaki reaksiyon kinetiğini ayarlamak için, dox üzerindeki dalga fonksiyonu simgesine çift tıklayın ve doxycycline.sin'i ayarlayın. genlik 10'a kadar.
Tetrasikline duyarlı baskılayıcı protein ile baskılayıcı bağlanma bölgesi arasındaki transkripsiyonel düzenleyici reaksiyonu uygulamak için, reaksiyon sekmesinden reaksiyonu seçin ve tetrasikline duyarlı baskılayıcı ile tetrasiklin operatörü arasındaki tuval üzerine yerleştirin. Simülasyon için bir başlangıç konsantrasyonu ve parametresi ayarlamak için her bir bileşene ve reaksiyona çift tıklayın. Simülasyona tıklayın, deterministik seçin ve devreyi 100 zaman birimi için simüle edin.
Simülasyon grafiğini kontrol panelinden ayarlayın ve SDHA ve tetrasikline duyarlı baskılayıcı proteinler için grafik modelini gözlemleyin. Standart biyolojik parçaların kayıt defterini açın, ardından aramaya tıklayın ve genetik bileşenin adını girin. CMV promotörün nükleotid dizisini elde etmek için, parça dizisini al seçeneğine tıklayın ve dosyayı bir metin dosyası olarak kaydedin.
SDHA'nın protein kodlama dizisini elde etmek için NCBI'yi açın ve arama penceresinin yanındaki açılır menüden nükleotidi seçin. Süksinat dehidrojenaz ve Mus musculus yazın ve nükleotid dizisini arayın. SDHA'nın kodlama sırasını almak ve diziyi bir metin dosyasına kaydetmek için CDS seçeneğine tıklayın.
Tüm genetik düzenleyici parçaların nükleotid dizisini tek bir dosyada sırayla birleştirin. Kozak dizisinden hemen sonra bir başlangıç kodonu ATG ekleyin ve yeni ortaya çıkan polipeptitlerin oluşumunu önlemek için dahili durdurma kodonlarını çıkarın. Expasy web sitesini açın ve nükleotid dizisini yapıştırın.
Diziyi çevir seçeneğine tıklayın, ardından beş asal üç asal çerçeve bir seçin ve durdurma kodonlarını çıkarın. Başlamak için, RAW264.7 hücrelerini 37 santigrat derecede %90 birleşme elde edilene kadar kültürleyin. İndüklenen sentetik devrenin paraziti ortadan kaldırıcı etkisini belirlemek için aşağıdaki örnekleri hazırlayın.
RAW264.7 hücrelerini 25 santimetre karelik bir şişeden kazıyın. Hücre süspansiyonunu 300G'de beş dakika santrifüjleyin ve peleti bir mililitre DMEM tam ortamda yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini 100 mikrolitrelik bir tüpe aktarın.
Hücrelere 10 mikrolitre% 0.5 tripan mavisi ekleyin ve iyice karıştırın. Hücre sayma haznesi sürgüsüne 10 mikrolitre hücre ve tripan mavisi karışımı yükleyin ve dört hazneden hücre sayımı yapın. Kapakta kuyucuk başına dört hücrenin gücüne iki kez 10 kez plaka, 96 oyuklu plakanın altına kaydırın ve 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Altı saatlik enfekte bir numune hazırlamak için, 10 dakika boyunca 7.273G'de bir mililitre sabit faz Leishmania majör promastigotlarını santrifüjleyin ve peleti 500 mikrolitre DMEM tam ortamda yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, kapak kayma alt 96 oyuklu plakadaki beş L.major promastigotun gücüne iki kez 10 ekleyin. Hücreleri altı saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyon sonrası, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. IMT ve IMTI örneklerini hazırlamak için, 6, 12, 18 ve 24 saat boyunca beş L.major promastigotun gücüne 10 kat büyütün. 1.5 mililitrelik bir tüpe, 24 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve bir mikrogram sentetik devre plazmidi ekleyin.
Başka bir 1.5 mililitrelik tüpte, 24 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve bir mikrolitre polietilenimin veya PEI ekleyin. En az 10 kez pipetleyerek iyice karıştırıyorum ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe ediyorum. PEI karışımını DNA'yı içeren 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve iyice karıştırın.
Tüpü 10 dakika inkübe edin. Ortamı 96 oyuklu kapak kayar alt plakasındaki kuyulardan atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Bir pipet kullanarak, DNA-PEI karışımını hücrelere damla damla ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın.
Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile üç saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücrelere 200 mikrolitre taze indirgenmiş serum ortamı ekleyin, plakayı hafifçe sallayın ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, ortamı atın.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, hücrelere genetik ve doksisiklin içeren DMEM tam besiyeri ekleyin ve 24 saat inkübe edin. Sentetik devrenin simülasyonu, hem SDHA'da hem de tetrasiklin baskılayıcısında salınım dinamiklerini ortaya çıkardı. Sentetik devrenin Escherichia coli DH5-alfa'ya sokulması, verimli dönüşümün göstergesi olan kanamisine direnç sergileyen dönüştürülmüş kolonilerle sonuçlandı.
Sentetik devre ile transfeksiyon ve doksisiklin ile indüksiyon, zaman içinde IMT hücrelerinde GFP ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdı. Transfeksiyon ve doksisiklin indüksiyonu sonrası, enfekte makrofajlarda hücre içi parazit yükünde önemli bir azalma gözlenmiştir. İnterlökin 10 ve interlökin 12'nin sitokin seviyeleri, enfeksiyondan altı saat sonra en yüksekti ve sentetik devrelerin transfeksiyonu ve indüksiyonu sırasında önemli bir fark gözlenmedi.
24 saatlik IMTI örneğinde tümör nekroz faktörü alfa, interferon gama ve dönüştürücü büyüme faktörü beta'da önemli bir artış gözlendi, bu da proinflamatuar sitokinlerin yukarı regülasyonunu gösterir.
