我们感谢 Daniel Hass 博士和 Jim Hurley 博士提出在新培养基与条件培养基中测试 O2 溶解度作为对照的想法。我们感谢 Magali Saint-Geniez 博士对手稿的编辑意见。我们感谢 Kellogg Eye Center 仪器和电子服务核心的 Scott Szalay 使用 Resipher USB 电缆改造了缺氧室。没有联邦资金用于 HFT 研究。电子服务核心由美国国家眼科研究所的 P30 EY007003提供支持。这项工作得到了预防失明研究 （RPB） 的无限制部门资助的支持。J.M.L.M. 得到了 James Grosfeld 干龄相关性黄斑变性倡议、E. Matilda Ziegler 盲人基金会、Eversight 眼库赠款、国家眼科研究所的 K08EY033420 赠款以及 Dee 和 Dickson Brown 以及 David 和 Lisa Drews 发现希望基金会的支持。DY 得到了新南威尔士大学科学计划的支持。L.A.K. 得到了 Iraty 奖、Monte J. Wallace、Michel Plantevin、美国国家眼科研究所的 R01EY027739 资助以及国防部陆军医学研究采购活动 VR220059 的支持。

有关建立人原代或 iPSC-RPE 培养物的方案，请参阅以下参考文献15、16、17、18。密歇根大学机构审查委员会 （HUM00105486） 审查并允许为这些方案采集和使用人体组织。
1. 系统在 RPE 培养中的一般应用
<ol><li>将人诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的 RPE 或原代人 RPE 细胞接种在系统兼容的 96 孔板中。<ol><li>假设已经存在的成熟培养物在 24 孔细胞培养板上生长，用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞一次，然后加入 500 μL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（材料表）。在细胞培养箱中孵育 10-40 分钟，每 5-10 分钟检查一次，直到细胞变圆并几乎可以分离。</li>
		<li>轻轻吸取培养基到细胞上，使其从细胞培养塑料上分离，然后转移至 3 倍体积的细胞培养基（每 24 孔 1,500 μL），在离心机中以 250 × g 的速度在室温下旋转 5 分钟。 注： RPE 细胞培养基的配方详见表 1，可在之前发布的参考文献9、15、16、17、18 中找到。</li>
		<li>在含有 15% 胎牛血清 （FBS） 的 RPE 细胞培养基中重悬细胞，并用血细胞计数器计数细胞。</li>
		<li>按照制造商的说明，用高度专业化的细胞外基质涂层底物（材料表）包被后，为 96 孔板的每个孔接种 74,000 个细胞（通常为 225-300 × 105 个细胞/cm2）。 注：仅在 Resipher 兼容板（材料表）上接种细胞，并且仅在与感应盖上的探针阵列相对应的孔中接种细胞（32 通道盖为第 3、4、9 和 10 列;参见材料表）。该系统的感应盖配有 4 通道、32 通道或 96 通道传感器（参见图 1A-D 中的传感器位置），并且兼容一系列标准细胞培养板。</li>
		<li>由于边缘孔容易蒸发，这会极大地影响氧气可用性，因此 OCR 读数，请避免在所有边缘孔（96 孔板的 A 行和 H 行）上接种细胞。此外，在 96 孔板的每个空孔中加入 200 μL 无菌水，以减少蒸发效应。</li>
		<li>将板放在稳定的桌面上 10 分钟，让细胞沉淀;然后将其放回培养箱中。24-72 小时后更换培养基，用含 5% FBS 的标准 RPE 培养基替换。培养至少 4 周，每周更换培养基 2 次。 注意：当细胞有色、圆石和高度紧凑时，它们就可以进行实验了（图 1E）。</li>
	</ol></li>
	<li>使用系统设置和采集数据<ol><li>将感应盖放在空的 96 孔接收板上，然后将其放回细胞培养箱中。将设备对齐并安装在感应盖上，然后通过提供的 USB 电缆将其连接到 Hub。这将创建一个 Resipher “三明治”。 （图 2A）。</li>
		<li>转到 Lucid 实验室网站应用程序 （https://lab.lucidsci.com/），然后单击右上角的 New Experiment 按钮以创建新实验。</li>
		<li>命名 实验的标题 并输入特定研究的任何相关 实验注释 （例如，正在使用的 iPSC-RPE 的传代号）。</li>
		<li>创建井况和处理组。例如，如果测试培养基中不同血清浓度对 OCR 的影响，请在组名称中选择 Serum，然后输入要使用的培养基血清浓度，并通过单击 + 按钮添加更多血清百分比值。分配哪些孔将接收特定的血清百分比，并为这些孔选择颜色模式。通过单击添加组按钮，根据需要添加更多组（例如，要测试的不同实验变量）。</li>
		<li>定义 板设置 并选择相应的 设备 和 板样式。点击 添加板 按钮，然后选择 设备;选择 Plate Type（板类型）。选择 treatment 并单击相应的孔。</li>
		<li>单击 start now 按钮以开始实验。检查 web网站上的指示灯和 Hub 上的 LED 是否 为稳定的绿色。</li>
		<li>让系统运行 15-60 分钟，以确保每个传感器都经过正确校准并准确检测大气中的氧气，在含 5% CO2 的完全加湿细胞培养箱中，大气中的氧气浓度应为 ~200 μM（图 2Bi）。 注意：如果任何传感器与标准细胞培养箱设置中其他传感器的平均值相差 20% 以上，请考虑在数据分析中排除该孔，因为传感器有故障（图 2Bii）。 注意：如果所有传感器都与其他传感器的平均值相差 20% 以上，并且与标准细胞培养箱设置中报告的预期大气 O2 相差 200 μM，则感应盖使用次数过多;用新的感应盖替换它（图 2Biii）。 注意：在开始实验之前获取空气中的 O2 读数可显著改善之后的故障排除。如果某个特定的孔在实验完成后显示为异常值，并且该孔的传感器未校准，则问题可能出在传感器上，而不是生物复制品上。</li>
		<li>从感应盖上取下设备（但不要从设备上拔下 USB 电缆）。将设备倒置在培养箱中，让设备上的电机复位。在所有电机声音停止之前（大约 20-30 秒），请勿重复使用该设备。 注意：在实验过程中，即使设备离开感应盖，也必须始终通过 USB 电缆将设备连接到 Hub。这使得该设备能够持续监测和报告细胞培养箱环境。</li>
		<li>将带有感应盖的板与含有 RPE 培养物的 96 孔板一起放回细胞培养罩中。用相同的培养基和相同的体积更换所有孔的 RPE 培养板中的培养基，以获得每个孔的基线 OCR 值。确保用无菌水填充所有没有 RPE 的孔，以帮助防止蒸发。 注：一般来说，我们建议每 96 孔 60-100 μL RPE 培养基，因为数据表明较低的培养基体积会导致营养物质的快速消耗，而较高的培养基体积会导致意外的缺氧9。</li>
		<li>将传感盖转移到含有细胞培养物的板上，并将含有细胞培养物的板上的标准（非 Resipher）盖子转移到空的 96 孔接收板上，以保持标准盖的无菌性，这在实验过程中的不同时间点都需要。</li>
		<li>将装有细胞培养物的板和感应盖放回细胞培养箱中。再次将设备对齐并安装在感应盖上，然后通过提供的 USB 电缆将其连接到 Hub（组装“三明治”）。检查 Web 站点界面和 Hub 上的指示灯是否均为 绿色常亮。 注意：O2 浓度数据将立即显示，而 OCR 数据仅在收集足够的 O2 数据后（大约 1 小时）才会显示。</li>
		<li>让设备测量每个孔上的 OCR 至少 12-24 小时以捕获基线 OCR。 注意：基线 OCR 会因许多因素而异，包括应用于单元格的介质类型。在 图 2C 中，具有不同 FBS 量（0%、5%、15%）的标准 RPE 培养基的 OCR 值略有不同。此外，在由于线粒体代谢物耗竭（曲线右侧）导致 OCR 下降之前，将培养基施用到细胞后，具有更多 FBS 的培养物可以维持线粒体活性更长时间。</li>
		<li>获得基线 OCR 后，重复步骤 1.2.8-1.2.12，但将带有 RPE 培养物的板上的培养基更改为自己的实验条件（通常，±药物或不同培养基条件的比较）。 注意：常规介质更换也可以用同样的方式处理。无论何时打开细胞培养箱，OCR 读数都会受到严重干扰，因为它们取决于温度、湿度、CO2 浓度和其他因素，而这些因素都会在培养箱门打开时暂时中断。在从感应盖中取出设备时，无需在线暂停实验。打开细胞培养箱门或更换被探测板上的培养基后，通常需要 2-4 小时才能重新建立氧梯度并开始测量准确的 OCR。</li>
		<li>获得数据后，在应用实验条件后从 OCR 中减去每个孔的 基线 OCR，以确定由处理触发的 Delta OCR 。</li>
		<li>实验完成后，对感应盖进行消毒并重复使用（可重复使用 3-5 次，但重复使用性能会降低）。要对感应盖进行消毒，请将整个盖子浸入细胞培养罩中的 70% 乙醇中 10 分钟，然后从浸入中取出并放在橱柜探针面朝上（避免接触精致的探针尖端），让乙醇和水完全蒸发，然后将感应盖放在新的 96 孔接收板上。</li>
	</ol></li>
	<li>拍摄明场图像以将 OCR 值标准化为细胞编号。 注意：RPE 中的黑色素积累有助于使用明场显微镜根据活培养物中细胞数的简单计数进行 OCR 的正常化。<ol><li>移除设备并将其倒置，如步骤 1.2.8 所示。在细胞培养通风橱中，将 RPE 培养板上的感应盖换成标准的 96 孔盖。</li>
		<li>使用标准倒置显微镜，拍摄每个孔的明场图像。 注意：保持孔之间的区域 1 图像一致（孔中的相对位置和物镜放大倍率）。</li>
		<li>在细胞培养通风橱中，将 RPE 培养板上的标准 96 孔盖更换为感应盖，然后将其放回培养箱中进行进一步监测。</li>
		<li>使用 ImageJ 或其他软件计算每个孔中的细胞数。</li>
		<li>将 OCR 标准化为不同实验组中的细胞数。系统以 fmol∙∙（mm2）-1∙s-1 为单位报告 OCR - 单位横截面积消耗量。因此，要标准化每个细胞的 OCR，请将 OCR 除以每 mm2 的细胞计数（而不是每个孔的细胞计数）。等效地，将系统报告的 OCR 乘以孔的横截面积（对于标准 96 孔板约为 31 mm2 ），以 fmol∙s -1 ∙well-1 为单位产生 OCR。</li>
	</ol></li>
	<li>用于确定 RPE 生物能量参数的对照。 注：为确保系统和 RPE 培养物以可预测的方式响应线粒体操作，可以测试某些成熟的小分子，以靶向线粒体氧化磷酸化的特定步骤。这些测试类似于使用 Seahorse Analyzer10 进行线粒体压力测试的步骤，并为 RPE 培养物提供生物能量图谱。<ol><li>在 65 μL 含 5% FBS 的标准 RPE 培养基中培养 RPE 细胞，并测量 OCR 24 小时以建立基线。</li>
		<li>吸出培养基并加入 65 μL 含 5% FBS 和线粒体解偶联剂（3 μM 羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙 [FCCP] 或 500 nM Bam15， 材料表）。孵育过夜。 注意：线粒体解偶联剂应显着增加 OCR。在标准培养条件下，确保增加的 OCR 不等于或接近理论最大扩散限制 OCR，即 65 μL 培养基约 275 fmol∙（mm2）-1∙s-1 。不同常用媒体卷的最大 OCR 可在 讨论 部分找到。</li>
		<li>孵育过夜后，用线粒体解偶联剂吸出培养基，并替换为 65 μL 含 5% FBS 的标准 RPE 培养基。再观察板 24 小时，以确定去除药物后 RPE OCR 的恢复率。</li>
		<li>通过从治疗前获得的 OCR 中减去治疗后获得的 OCR 来计算解耦剂对 OCR 的影响（图 3）。 注：添加线粒体解偶联剂后 OCR 的增加表明细胞的储备线粒体呼吸能力19。</li>
		<li>要使用 Seahorse 分析仪测量线粒体压力测试期间通常捕获的其他线粒体参数，请对以下化合物执行上述相同的步骤（图 4）。<ol><li>使用 1 μM 的寡霉素评估 ATP 相关呼吸。</li>
			<li>使用 1 μM 的抗霉素 A 和鱼藤酮来评估任何非线粒体呼吸。 注：FCCP、寡霉素、抗霉素 A 和鱼藤酮可能对 RPE 有毒。如果它们诱导显着的细胞死亡，则 OCR 测量将不准确。因此，OCR 测量值应仅在没有明显细胞死亡的时间点获得，通常在添加药物后的最初几个小时内（图 4）。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. 测量接受 EMT 的 RPE 中线粒体代谢的变化
<ol><li>遵循第 1.2 节中概述的相同协议。</li>
	<li>为了在获得基线 OCR 测量值后诱导 EMT，将 TGF-β2 （10 ng/mL） 添加到 RPE 培养物中，并在 3 周内监测 OCR。每 2-3 天用新鲜的 TGFβ 2 刷新培养基（图 5）。</li>
	<li>每周至少 2 次，如第 1.3 节所示获得明场图像，以确保细胞计数不变。如果计数发生变化，请将 OCR 值标准化为每个孔中的细胞数。 注意：相同的方案可用于 EMT 的其他诱导剂，以监测细胞在培养箱中时在整个培养期间的长期 OCR 变化。</li>
</ol>3. 测量缺氧 RPE 中线粒体代谢的变化
注：该系统在低氧、常氧或高氧条件下的应用与第 1.2 节相同，只是将“三明治”保存在放置在标准细胞培养箱中的缺氧室（材料表）中。
<ol><li>在缺氧室的盖子上钻一个孔，将 USB type-c 电缆安装，并用硅胶或腻子密封（图 6A）。</li>
	<li>将感应盖与通风橱中的细胞培养板组装在一起，然后将它们转移到缺氧室中。</li>
	<li>在缺氧室中设置“三明治”（板、感应盖、设备）。还要在缺氧室中放置一个装有无菌水的培养皿，以帮助保持湿度。最后，将便携式 O2 传感器放入缺氧室（材料表）。设置如图 6A 所示。</li>
	<li>密封腔室并将其连接到低氧浓度为 O2 且标准细胞培养浓度为 CO2 的气瓶（例如，1% O2 和 5% CO2）。</li>
	<li>将缺氧室中的空气与气瓶中的 1% O2/5% CO2 空气缓慢交换，直到氧传感器显示所需的 O2 浓度，通常在 1% 到 10% 之间。 注意：便携式 O2 传感器需要时间来平衡，因此应将气瓶中的气体缓慢添加到缺氧室中。</li>
	<li>关闭缺氧室的入口和出口阀，将整个腔室转移到培养箱中。</li>
	<li>按照第 1.2 节设置并开始实验。 注：在添加到细胞中之前，在缺氧室中预平衡培养基可以减少细胞单层经历真正缺氧所需的时间（图 6B）。</li>
</ol>4. 计算 RPE 单层的 O2 浓度，以确定细胞是否处于低氧、常氧或高氧状态
注：默认情况下，系统在孔底上方约 1 至 1.5 mm 之间测量 O2 浓度，假设使用标准板和相应的推荐传感盖进行单层培养（参见 https://lucidsci.com/docs/LucidScientific_Sensing_Lid_Selection_Guide.pdf）。虽然细胞单层的 O2 浓度不能直接测量，但来自系统的数据可用于估计 RPE 水平的 O2 浓度。具体来说，知道在培养基柱顶部（O2 可用）和培养基柱底部（O2 被消耗）之间存在氧梯度，菲克扩散定律可以与测得的 OCR 速率相结合，以推断细胞单层的 O2 水平。此估计的计算器在线提供：https://lucidsci.com/notes?entry=oxygen_diffusion（https://observablehq.com/@lucid/oxygen-diffusion-and-flux-in-cell-culture 以开源交互式笔记本的形式提供，此计算器的源代码可在 https://github.com/lucidsci/oxygen-diffusion-calculator 中找到）。
<ol><li>访问计算器后，以 微升为单位输入培养基体积 （例如 100 μL）。</li>
	<li>在气液界面（单元格上方的介质列顶部）输入饱和氧浓度。在标准大气压、5% O2 和 95% 湿度下，该值为 ~185 μM。 注：这也可以通过系统探针在仅培养基的孔（孔底部没有细胞）中的 O2 测量值来确定。</li>
	<li>在 Flux （通量） 输入中，输入系统报告的 Flux/OCR （通量/OCR ）。</li>
	<li>根据这些值，计算 介质列中每个高度的稳态氧浓度 ，并在图中显示（图 7）。绘图的 x 轴 是 孔底部上方的高度（以 mm 为单位）。 y 轴 是 该高度处计算的 O2 浓度 （以 μM 为单位）。</li>
	<li>孔底部（细胞所在的位置）的 O2 浓度在图下方的行中报告。 注意：一般来说，估计 体内 RPE 的 O2 浓度为 4-9%。在标准大气条件下，每 10 μM O2 相当于约 1% 的 O2。因此，细胞水平的常氧约为 40-90 μM O2。介质柱越高，O2 在 RPE 单层9 的水平上就越低。因此，如果细胞似乎处于缺氧状态，则可以减少培养基体积。如果细胞似乎处于高氧状态，则可以增加培养基体积。</li>
</ol>

用于分化 RPE 培养物的新型 OCR 监测系统

<ol>
	<li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+EndMT:+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration.">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271 (2020).</li><li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+transdifferentiation:+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis.">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li><li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium:+a+busy+intersection.">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration.">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420 (2023).</li><li>Hansman, D. 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O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li><li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system.">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li><li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats.">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560 (2023).</li><li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets.">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922 (2024).</li><li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystine/glutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox,+bioenergetics+and+differentiation.">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213 (2024).</li><li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth.">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355 (2024).</li><li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology.">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li><li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics.">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125 (2023).</li></ol>

Richard A. Bryan 和 Kin Lo 是 Lucid Scientific 的员工，该公司生产 Resipher 系统。

RPE 的线粒体代谢在常见致盲性视网膜疾病（包括 AMD 和 PVR）的发病机制中起关键作用。 在体外 模拟 RPE 线粒体代谢可以使其代谢状态与周围组织的代谢状态隔离开来，同时以受控方式使组织受到不同的疾病模拟损伤。高保真人原代和 iPSC-RPE 培养物的出现促进了 RPE 线粒体代谢的这种 体外 建模，这些培养物获得了在 体内紧密接近 RPE 所需的适当分化状态和极性。虽然监测此类...

视网膜色素上皮 （RPE） 是单层功能性有丝分裂后高度极化的上皮细胞，在视网膜中的光敏感光感受器与其血液循环之间形成屏障，毛细血管床称为脉络膜毛细血管。与神经胶质细胞支持神经元的作用一样，RPE 执行多种功能来支持光感受器，包括光感受器外段的吞噬作用、营养物质的运输和光感受器的代谢支持，以及必需生长因子的分泌，所有这些都对维持视觉功能至关重要。
RPE 的退化是几种常见的退行性视力障碍的基础。年龄相关性黄斑变性 （AMD） 是世界上无法治愈的视力丧失的最常见原因之一，RPE 死亡，因此覆盖的光感受器遭受继发性变性。在增生性玻璃体视网膜病变 （PVR） 中，RPE 反而退出其正常的静止有丝分裂后状态，增殖并去分化为间充质状态（所谓的上皮到间充质转化 [EMT]），其代谢发生变化。RPE 去分化导致 RPE 对光感受器的支持丧失，同时也会触发更多的纤维化状态。这会导致光感受器变性和 RPE 诱导的瘢痕形成，这两者都会引发视力丧失 1,2。
RPE 对光感受器的支持主要部分是代谢，代谢失调是许多视网膜疾病的关键因素，包括 AMD 和 PVR。RPE 是光感受器与其氧气和营养来源（脉络膜毛细血管）之间的调节屏障。因此，RPE 选择代谢的物质与 RPE 选择从脉络膜毛细血管传递到光感受器的物质强烈控制着光感受器的代谢和存活。大量研究表明，RPE 的正常健康严重依赖线粒体代谢，而光感受器则严重依赖糖酵解3。这引入了光感受器和 RPE 之间互补、交织的代谢状态的概念。具体来说，RPE 减少了其对优选光感受器代谢底物的代谢，而是利用光感受器代谢的副产物与光感受器不消耗的代谢物相结合。在 PVR 和 AMD 等疾病中，有证据表明 RPE 变得更加糖酵解，对线粒体代谢的依赖性降低;这种向 RPE 糖酵解的转变可能会使光感受器缺乏所需的代谢物，从而引发退化 4,5,6。鉴于 RPE 和光感受器代谢的相互依赖性以及视网膜疾病基础代谢的改变程度，人们对为治疗目的建模和操纵 RPE 代谢产生了浓厚的兴趣。
虽然在体内研究 RPE 线粒体代谢是理想的，但 RPE 线粒体代谢的许多方面只能在体外培养系统中实际探测。在过去的几十年里，高保真 RPE 培养物取得了重大进展，以至于最精心修饰的 RPE 培养物现在被用于人体临床试验中的细胞替代疗法7。为了保持这种高保真培养物，RPE 需要在实验前在特定培养基的特定底物上生长数月。在这些条件下，RPE 培养物最大程度地分化和极化，接近体内 RPE。不幸的是，目前没有可用的设备可以专门从体内 RPE 测量线粒体代谢。虽然已经使用电子顺磁共振 （EPR） 血氧饱和度8 在体内实现了视网膜毛细血管网络的氧气监测，但这无法用于 RPE 分析。体内和体外 RPE 代谢之间的差异尚未得到很好的描述，但 RPE 培养物已被证明具有高线粒体活性，类似于体内 RPE 3,9，表明使用高保真 RPE 培养物可以深入了解 RPE 线粒体代谢。
由于所有线粒体代谢都会导致耗氧量，因此测量 RPE 耗氧率 （OCR） 是线粒体代谢的忠实代表。在 RPE 培养物中测量 OCR 一直很困难，因为促进最大 RPE 极化和分化的条件通常妨碍使用当前可用的技术（如 Seahorse 分析仪）进行长期准确的 OCR 测量。在该方法论文中，介绍了一种称为 Resipher（以下简称“系统”）的新型设备，该设备允许在最大程度促进极化和分化的条件下生长的 RPE 中连续测量数周的 OCR。该系统在最大限度地促进 RPE 分化和极化的 RPE 培养条件下测量 OCR 的难易程度在现有的 OCR 测量设备中是独一无二的。
本文提供了将系统与 RPE 培养物一起使用的提示和技巧，然后演示了两种特定应用。首先，模拟 PVR 的 RPE EMT 是由暴露于转化生长因子-β （TGFβ） 触发的1,10,11,12。该系统用于监测 RPE 代谢在 EMT 过程中的演变情况。其次，使用该系统探索缺氧在 RPE 代谢中的作用。缺氧是 AMD 发病机制的重要因素，因为脉络膜毛细血管会随着13,14 岁的年龄而变薄。将该系统与缺氧室相结合，可以模拟改变的 RPE 线粒体代谢与伴随衰老的微妙缺氧。最后，引入了一个使用 Resipher 数据的在线计算器，以允许人们确定 RPE 培养物是否处于低氧、常氧或高氧条件下。这些信息对于从体外 RPE 培养研究中得出有关 RPE 代谢的任何结论至关重要。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel Resipher lid</td>
			<td>Lucid Scientific</td>
			<td>NS32-101A for Falcon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Inhibitor of Complex III of the electron transport chain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAM15</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1760-5MG</td>
			<td>Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td>Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix coating substrates: 
			Synthemax II-SC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3535</td>
			<td>Extracellular matrix for hfRPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Extracellular matrix for iPSC-RPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td>Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-Cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia chamber</td>
			<td>Embrient Inc.</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Media Supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Sensit technology or Forensics Detectors</td>
			<td>P100 or FD-90A-O2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-35B</td>
			<td>Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td>Inhibitor of Complex I of the electron transport chain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System-compatible plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM (Alpha Modification of Eagle&#39;s Media)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-012-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term monitoring of oxygen consumption rates in highly differentiated and polarized retinal pigment epithelial cultures

线粒体代谢对于视网膜色素上皮 （RPE） 的正常功能至关重要，RPE 是视网膜中对光感受器存活很重要的单层细胞。RPE 线粒体功能障碍是年龄相关性黄斑变性 （AMD） 的标志，AMD是发达国家不可逆性失明的主要原因，以及增生性玻璃体视网膜病变 （PVR），一种视网膜脱离的致盲并发症。RPE 退行性疾病已被 RPE 培养系统很好地建模，这些系统具有高度分化和极化以模拟 体内 RPE。然而，在此类培养系统中，监测耗氧率 （OCR）（线粒体功能的代表）一直很困难，因为促进理想 RPE 极化和分化的条件不允许轻松进行 OCR 测量。 
在这里，我们介绍了一种新型系统 Resipher，该系统可在分化良好的 RPE 培养物中一次监测数周的 OCR，同时在标准细胞培养箱中将 RPE 保持在最佳生长基质和生理培养基上。该系统通过测量细胞上方培养基中存在的氧浓度梯度来计算 OCR。我们讨论了该系统相对于其他检测 OCR 方法的优势，以及如何设置用于测量 RPE 培养物中 OCR 的系统。我们介绍了使用系统的关键提示和技巧、解释数据的注意事项以及排查意外结果的指南。 
我们还提供了一个在线计算器，用于根据系统检测到的细胞上方培养基中的氧梯度推断低氧、常氧或高氧 RPE 培养的水平。最后，我们回顾了该系统的两种应用，在 PVR 模型中测量 RPE 细胞的代谢状态，并了解 RPE 如何代谢适应缺氧。我们预计在高度极化和分化的 RPE 培养物上使用该系统将增强我们对生理和疾病状态下 RPE 线粒体代谢的理解。

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of functionally postmitotic, highly polarized epithelial cells that form a barrier between light-sensitive photoreceptors in the retina and their blood circulation, a capillary bed termed the choriocapillaris. Like the role of glia-supporting neurons, the RPE carries out myriad functions to support photoreceptors, including phagocytosis of photoreceptor outer segments, transport of nutrients and metabolic support for photoreceptors, and secretion of essential growth factors, all critical for maintaining visual function.
Degeneration of the RPE underlies several common degenerative disorders of vision. In age-related macular degeneration (AMD), one of the most common causes of incurable vision loss in the world, the RPE dies, and overlying photoreceptors therefore suffer a secondary degeneration. In proliferative vitreoretinopathy (PVR), the RPE instead exits its normally quiescent postmitotic state, proliferating and dedifferentiating into a mesenchymal state (a so-called epithelial-to-mesenchymal transition [EMT]) with alterations in its metabolism. RPE dedifferentiation causes a loss of RPE support to photoreceptors while also triggering a more fibrotic state. This results in both photoreceptor degeneration and RPE-induced scarring, both of which trigger vision loss1,2.
A major part of the RPE&#39;s support to photoreceptors is metabolic, and metabolic dysregulation is a critical factor in numerous retinal diseases, including AMD and PVR. The RPE serves as a regulatory barrier between photoreceptors and their source of oxygen and nutrients, the choriocapillaris. Thus, what the RPE chooses to metabolize versus what the RPE chooses to pass through from the choriocapillaris to the photoreceptors strongly governs photoreceptor metabolism and survival. Numerous studies have shown that the RPE is heavily dependent on mitochondrial metabolism for its normal health, and that photoreceptors instead rely heavily on glycolysis3. This has introduced the concept of complementary, intertwined metabolic states between photoreceptors and the RPE. Specifically, the RPE reduces its metabolism of preferred photoreceptor metabolic substrates and instead utilizes the byproducts of photoreceptor metabolism combined with the metabolites that photoreceptors do not consume. In diseases such as PVR and AMD, evidence strongly suggests that the RPE becomes more glycolytic and less dependent on mitochondrial metabolism; this shift towards RPE glycolysis may starve photoreceptors of metabolites it needs, triggering degeneration4,5,6. Given how interdependent RPE and photoreceptor metabolism are and how much altered metabolism underlies retinal disease, there is strong interest in modeling and manipulating RPE metabolism for therapeutic purposes.
While studying RPE mitochondrial metabolism in vivo is ideal, many aspects of RPE mitochondrial metabolism can only be practically probed in an in vitro culture system. Significant progress towards high-fidelity RPE cultures has been made in the past several decades, to the point that the most carefully groomed RPE cultures are now being used for cell replacement therapy in human clinical trials7. To maintain such high-fidelity cultures, the RPE needs to be grown on particular substrates in particular media for months prior to experimentation. With these conditions, RPE cultures are maximally differentiated and polarized, approximating in vivo RPE. Unfortunately, there is no equipment currently available that can measure mitochondrial metabolism specifically from the RPE in vivo. While oxygen monitoring of the retinal capillary network has been achieved in vivo using electron paramagnetic resonance (EPR) oximetry8, this is not possible for RPE analysis. Differences between RPE metabolism in vivo and in vitro are not well-described, but RPE cultures have been shown to have high mitochondrial activity, similar to RPE in vivo3,9, suggesting significant insight into RPE mitochondrial metabolism can be gained using high-fidelity RPE cultures.
As all mitochondrial metabolism leads to oxygen consumption, measuring RPE oxygen consumption rates (OCR) is a faithful proxy for mitochondrial metabolism. Measuring OCR in RPE cultures has been difficult, as the conditions that promote maximal RPE polarization and differentiation often preclude long-term accurate OCR measurements with currently available techniques, such as the Seahorse Analyzer. In this methods paper, a novel device, termed the Resipher (hereafter referred to as &#34;the system&#34;), is introduced, which allows continuous measurement of OCR over weeks in RPE grown under conditions that maximally promote polarization and differentiation. The ease with which OCR can be measured by this system in RPE culture conditions that maximally promote RPE differentiation and polarization is unique among existing OCR-measuring devices.
This paper provides tips and tricks for using the system with RPE cultures, followed by a demonstration of two particular applications. First, RPE EMT, mimicking PVR, is triggered by exposure to transforming growth factor-beta (TGF&#946;)1,10,11,12. The system is used to monitor how RPE metabolism evolves during the EMT process. Second, the role of hypoxia in RPE metabolism is explored using this system. Hypoxia is an important contributor to the pathogenesis of AMD, as the choriocapillaris thins with age13,14. Combining this system with hypoxia chambers allows one to model altered RPE mitochondrial metabolism with the subtle hypoxia that accompanies aging. Finally, an online calculator using Resipher data is introduced to allow one to determine whether RPE cultures are in hypoxic, normoxic, or hyperoxic conditions. Such information is critical for drawing any conclusions about RPE metabolism from in vitro RPE culture studies.

作者聚焦：使用 Resipher 进行视网膜色素上皮的扩展耗氧量测量

长期监测高度分化和极化视网膜色素上皮培养物中的耗氧率

Degeneration of the RPE, or retinal pigment epithelium, underlies many causes of vision loss. Mitochondrial dysfunction underlies this RPE degeneration in many cases. We can measure mitochondrial function by looking at oxygen consumption rates, or OCR.Here we introduce a new method for measuring OCR in the RPE. Thanks to the work from multiple labs, it's now well-established, the RPE requires mitochondrial activity to maintain its health and function. Research is now more focused on what nutrients the RPE preferentially uses, and if that changes under stress.Prior methods for assessing OCR in RPE have limitations. Either the RPE was grown in non-ideal conditions, or it could not be assessed over long periods of time. So measuring OCR in high fidelity cultures that maintain features in vivo is one of the main challenges.The method for monitoring OCR introduced in this manuscript enables us to measure OCR over a week while manipulating the RPE under multiple experimental challenges. This is all done while the RPE is in ideal culture conditions that allows it to mimic ideal RPE in vivo. Recipher is a novel device for long-term monitoring of oxygen consumption in cell cultures, such as retinal pigment epithelium.Unlike short-term methods like seahorse analyzer, recipher supports extended monitoring under standard conditions, enabling detailed bioenergetic profiling over weeks while preserving cell health.

Resipher 实验的“夹心”设置如图 2A 所示。带有 32 个探针的传感盖对应于 96 孔板上的第 3、4、9 和 10 列，位于细胞板和设备之间。连接到集线器后，该设备激活电机上下移动感应盖，在细胞单层上方的一系列高度（通常为 1-1.5 mm）测量培养基柱中的 O2 浓度。因此，通过记录单层上方这些不同高度的 O2 浓度来连续测量 O2 梯度。通过梯度测量和应用 Fic...

我们介绍了一种用于测量视网膜色素上皮 （RPE） 培养物中耗氧率 （OCR） 的新型设备。当板位于标准细胞培养箱中时，该设备可以一次测量在标准培养基的标准细胞培养板上生长的 RPE 上数周的 OCR。

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

4.3K 次观看.  University of Michigan, Ann Arbor. RPE 或视网膜色素上皮的退化是视力丧失的许多原因的基础。在许多情况下，线粒体功能障碍是这种 RPE 变性的基础。我们可以通过查看耗氧率或 OCR 来测量线粒体功能。在这里，我们介绍了一种在 RPE 中测量 OCR 的新方法。由于多个实验室的工作，现在已经很成熟，RPE 需要线粒体活性来维持其健康和功能。现在的研究更侧重于 RPE 优先使用哪些营...