Dr. Daniel Hass ve Jim Hurley'e, O2 çözünürlüğünü yeni ve koşullu ortamlarda bir kontrol olarak test etme fikri için teşekkür ederiz. Dr. Magali Saint-Geniez'e el yazması üzerindeki editoryal katkıları için teşekkür ederiz. Kellogg Göz Merkezi, Instrument and Electronic Services Core'dan Scott Szalay'a, hipoksi odasını Resipher USB kablosuyla güçlendirdiği için teşekkür ederiz. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Elektronik Hizmetler Çekirdeği, Ulusal Göz Enstitüsü'nden P30 EY007003 tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan (RPB) sınırsız bir bölüm hibesi ile desteklenmektedir. J.M.L.M., James Grosfeld Kuru Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu Girişimi, E. Matilda Ziegler Körler Vakfı, Eversight göz bankası hibesi, Ulusal Göz Enstitüsü'nden K08EY033420 hibesi ve Dee ve Dickson Brown'ın yanı sıra David ve Lisa Drews Umudu Keşfetme Vakfı tarafından desteklenmektedir. D.Y.S., UNSW Scientia Programı tarafından desteklenmektedir. L.A.K., Iraty Ödülü, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, Ulusal Göz Enstitüsü'nden bir R01EY027739 hibe ve Savunma Bakanlığı Ordusu Tıbbi Araştırma Satın Alma Faaliyeti VR220059 tarafından desteklenmektedir.

Farklılaştırılmış RPE Kültürleri için Yeni OCR İzleme Sistemi

<ol>
	<li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+EndMT:+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration.">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271 (2020).</li><li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+transdifferentiation:+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis.">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li><li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium:+a+busy+intersection.">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration.">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420 (2023).</li><li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904 (2024).</li><li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy.">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213 (2021).</li><li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium:+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery.">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li><li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging.">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li><li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures.">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4 (2023).</li><li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PGC-1&#945;+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF&#946;2-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells.">Suppression of PGC-1&#945; drives metabolic dysfunction in TGF&#946;2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701 (2021).</li><li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786 (2022).</li><li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF&#946;2+and+TNF&#945;+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition.">Divergent metabolomic signatures of TGF&#946;2 and TNF&#945; in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213 (2023).</li><li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration.">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41 (2023).</li><li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration,+a+mathematically+tractable+disease.">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4 (2024).</li><li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue.">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li><li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology.">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032 (2010).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures.">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li><li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells.">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582 (2022).</li><li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+spare+respiratory+capacity:+Mechanisms,+regulation,+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells.">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li><li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration.">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li><li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry.">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li><li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li><li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system.">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li><li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats.">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560 (2023).</li><li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets.">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922 (2024).</li><li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystine/glutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox,+bioenergetics+and+differentiation.">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213 (2024).</li><li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth.">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355 (2024).</li><li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology.">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li><li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics.">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125 (2023).</li></ol>

Richard A. Bryan ve Kin Lo, Resipher sistemini üreten Lucid Scientific'in çalışanlarıdır.

RPE'nin mitokondriyal metabolizması, AMD ve PVR dahil olmak üzere yaygın kör edici retina hastalıklarının patogenezinde kritik bir rol oynar. RPE mitokondriyal metabolizmasının in vitro olarak modellenmesi, kişinin metabolik durumunu çevre dokularınkinden izole etmesine ve dokuyu kontrollü bir şekilde farklı hastalık simüle eden hakaretlere maruz bırakmasına olanak tanır. RPE mitokondriyal metabolizmasının bu tür in vitro modellemesi, in vivo RPE'ye yakın bir şekilde ya...

Retina pigment epiteli (RPE), retinadaki ışığa duyarlı fotoreseptörler ile kan dolaşımı arasında bir bariyer oluşturan, fonksiyonel olarak postmitotik, oldukça polarize epitel hücrelerinin tek tabakasıdır, koryokapillaris olarak adlandırılan bir kılcal yataktır. Glia destekleyici nöronların rolü gibi, RPE de fotoreseptör dış segmentlerinin fagositozu, besinlerin taşınması ve fotoreseptörler için metabolik destek ve temel büyüme faktörlerinin salgılanması dahil olmak üzere fotoreseptörleri desteklemek için sayısız işlevi yerine getirir ve bunların tümü görsel işlevi sürdürmek için kritik öneme sahiptir.
RPE'nin dejenerasyonu, birkaç yaygın dejeneratif görme bozukluğunun temelini oluşturur. Dünyada tedavi edilemez görme kaybının en yaygın nedenlerinden biri olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), RPE ölür ve bu nedenle üstteki fotoreseptörler ikincil bir dejenerasyona uğrar. Proliferatif vitreoretinopatide (PVR), RPE bunun yerine normalde hareketsiz olan postmitotik durumundan çıkar, çoğalır ve metabolizmasındaki değişikliklerle mezenkimal duruma (epitelyalden mezenkimal geçişe [EMT] olarak adlandırılır) farklılaşır. RPE farklılaşması, fotoreseptörlere RPE desteğinin kaybına neden olurken aynı zamanda daha fibrotik bir durumu tetikler. Bu, hem fotoreseptör dejenerasyonu hem de RPE'nin neden olduğu yara izi ile sonuçlanırve her ikisi de görme kaybını tetikler 1,2.
RPE'nin fotoreseptörlere desteğinin büyük bir kısmı metaboliktir ve metabolik düzensizlik, AMD ve PVR dahil olmak üzere çok sayıda retina hastalığında kritik bir faktördür. RPE, fotoreseptörler ile oksijen ve besin kaynakları olan koryokapillaris arasında düzenleyici bir bariyer görevi görür. Bu nedenle, RPE'nin metabolize etmeyi seçtiği şeye karşı RPE'nin koryokapilleristen fotoreseptörlere geçmeyi seçtiği şey, fotoreseptör metabolizmasını ve sağkalımını güçlü bir şekilde yönetir. Çok sayıda çalışma, RPE'nin normal sağlığı için büyük ölçüde mitokondriyal metabolizmaya bağımlı olduğunu ve fotoreseptörlerin bunun yerine büyük ölçüde glikoliz3'e dayandığını göstermiştir. Bu, fotoreseptörler ve RPE arasında tamamlayıcı, iç içe geçmiş metabolik durumlar kavramını ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, RPE, tercih edilen fotoreseptör metabolik substratlarının metabolizmasını azaltır ve bunun yerine fotoreseptörlerin tüketmediği metabolitlerle birlikte fotoreseptör metabolizmasının yan ürünlerini kullanır. PVR ve AMD gibi hastalıklarda, kanıtlar RPE'nin daha glikolitik hale geldiğini ve mitokondriyal metabolizmaya daha az bağımlı hale geldiğini güçlü bir şekilde göstermektedir; RPE glikolize doğru bu kayma, ihtiyaç duyduğu metabolitlerin fotoreseptörlerini aç bırakarak dejenerasyonu tetikleyebilir 4,5,6. RPE ve fotoreseptör metabolizmasının ne kadar birbirine bağımlı olduğu ve retina hastalığının altında ne kadar değişmiş metabolizma olduğu göz önüne alındığında, RPE metabolizmasının terapötik amaçlar için modellenmesi ve manipüle edilmesine büyük ilgi vardır.
RPE mitokondriyal metabolizmasını in vivo olarak incelemek ideal olsa da, RPE mitokondriyal metabolizmasının birçok yönü sadece bir in vitro kültür sisteminde pratik olarak incelenebilir. Son birkaç on yılda, yüksek kaliteli RPE kültürlerine doğru önemli ilerlemeler kaydedilmiştir, öyle ki, en dikkatli şekilde tımar edilen RPE kültürleri şu anda insan klinik çalışmalarında hücre replasman tedavisi için kullanılmaktadır7. Bu tür yüksek kaliteli kültürleri korumak için, RPE'nin deneyden aylar önce belirli ortamlarda, belirli substratlarda büyütülmesi gerekir. Bu koşullarla, RPE kültürleri maksimum düzeyde farklılaşır ve polarize edilir, bu da in vivo RPE'ye yaklaşır. Ne yazık ki, şu anda mitokondriyal metabolizmayı özellikle in vivo olarak RPE'den ölçebilecek hiçbir ekipman mevcut değildir. Retina kılcal damar ağının oksijen izlemesi, elektron paramanyetik rezonans (EPR) oksimetre8 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilmiş olsa da, RPE analizi için bu mümkün değildir. RPE metabolizması in vivo ve in vitro arasındaki farklar iyi tanımlanmamıştır, ancak RPE kültürlerinin RPE'ye benzer şekilde yüksek mitokondriyal aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir in vivo 3,9, bu da RPE mitokondriyal metabolizması hakkında önemli bilgiler edinilebileceğini düşündürmektedir.
Tüm mitokondriyal metabolizma oksijen tüketimine yol açtığından, RPE oksijen tüketim oranlarının (OCR) ölçülmesi mitokondriyal metabolizma için sadık bir vekildir. Maksimum RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar genellikle Denizatı Analizörü gibi şu anda mevcut olan tekniklerle uzun vadeli doğru OCR ölçümlerini engellediğinden, RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek zor olmuştur. Bu yöntem makalesinde, polarizasyonu ve farklılaşmayı maksimum düzeyde destekleyen koşullar altında yetiştirilen RPE'de OCR'nin haftalar boyunca sürekli olarak ölçülmesine izin veren Resipher (bundan böyle "sistem" olarak anılacaktır) olarak adlandırılan yeni bir cihaz tanıtılmaktadır. RPE farklılaşmasını ve polarizasyonunu maksimum düzeyde destekleyen RPE kültür koşullarında OCR'nin bu sistem tarafından ölçülebilme kolaylığı, mevcut OCR ölçüm cihazları arasında benzersizdir.
Bu makale, sistemi RPE kültürleriyle kullanmak için ipuçları ve püf noktaları sağlar, ardından iki özel uygulamanın bir gösterimi yapılır. İlk olarak, PVR'yi taklit eden RPE EMT, dönüştürücü büyüme faktörü-beta'ya (TGFβ) maruz kalarak tetiklenir1,10,11,12. Sistem, EMT süreci sırasında RPE metabolizmasının nasıl geliştiğini izlemek için kullanılır. İkinci olarak, hipoksi'nin RPE metabolizmasındaki rolü bu sistem kullanılarak araştırılmıştır. Hipoksi, koryokapillaris13,14 yaşla birlikte inceldiği için AMD'nin patogenezine önemli bir katkıda bulunur. Bu sistemi hipoksi odalarıyla birleştirmek, yaşlanmaya eşlik eden ince hipoksi ile değişmiş RPE mitokondriyal metabolizmasını modellemeye izin verir. Son olarak, RPE kültürlerinin hipoksik, normoksik veya hiperoksik koşullarda olup olmadığını belirlemeye izin vermek için Resipher verilerini kullanan bir çevrimiçi hesap makinesi tanıtıldı. Bu tür bilgiler, in vitro RPE kültür çalışmalarından RPE metabolizması hakkında herhangi bir sonuç çıkarmak için kritik öneme sahiptir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25-200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32-channel Resipher lid</td>
			<td>Lucid Scientific</td>
			<td>NS32-101A for Falcon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Inhibitor of Complex III of the electron transport chain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAM15</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1760-5MG</td>
			<td>Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, cell culture grade</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td>Vehicle for reconstituting mitochondrial drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix coating substrates: 
			Synthemax II-SC</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#3535</td>
			<td>Extracellular matrix for hfRPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix coating substrates: Vitronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Extracellular matrix for iPSC-RPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td>Uncoupling agent to increase mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Bio-Techne S11550H)</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S11550H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone-Cyclodextrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia chamber</td>
			<td>Embrient Inc.</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N1 Media Supplement</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 sensor</td>
			<td>Sensit technology or Forensics Detectors</td>
			<td>P100 or FD-90A-O2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human TGF&#946;2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-35B</td>
			<td>Transforming growth factor beta-2 to induce epithelial-mesenchymal transition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td>Inhibitor of Complex I of the electron transport chain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System-compatible plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM (Alpha Modification of Eagle&#39;s Media)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-012-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term monitoring of oxygen consumption rates in highly differentiated and polarized retinal pigment epithelial cultures

Mitokondriyal metabolizma, retinada fotoreseptörün sağkalımı için önemli olan tek bir hücre tabakası olan retina pigment epitelinin (RPE) normal işlevi için kritik öneme sahiptir. RPE mitokondriyal disfonksiyonu, gelişmiş dünyada geri dönüşü olmayan körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve retina dekolmanlarının kör edici bir komplikasyonu olan proliferatif vitreoretinopatinin (PVR) ayırt edici bir özelliğidir. RPE dejeneratif koşulları, in vivo RPE'yi taklit etmek için oldukça farklılaşmış ve polarize edilmiş RPE kültür sistemleri tarafından iyi modellenmiştir. Bununla birlikte, mitokondriyal fonksiyonun bir temsilcisi olan oksijen tüketim oranlarının (OCR) izlenmesi, bu tür kültür sistemlerinde zor olmuştur, çünkü ideal RPE polarizasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen koşullar kolay OCR ölçümlerine izin vermez. 
Burada, RPE'yi standart bir hücre kültürü inkübatöründe optimal büyüme substratları ve fizyolojik kültür ortamı üzerinde tutarken, iyi farklılaşmış RPE kültürlerinde OCR'yi haftalarca izlemek için yeni bir sistem olan Resipher'ı tanıtıyoruz. Bu sistem, hücrelerin üzerindeki ortamda bulunan oksijen konsantrasyonu gradyanını ölçerek OCR'yi hesaplar. Bu sistemin OCR'yi tespit etmek için diğer yöntemlere göre avantajlarını ve RPE kültürlerinde OCR'yi ölçmek için sistemin nasıl kurulacağını tartışıyoruz. Sistemi kullanmayla ilgili önemli ipuçlarını ve püf noktalarını ele alıyor, verileri yorumlama konusunda uyarıda bulunuyor ve beklenmeyen sonuçları gidermeye yönelik yönergeleri ele alıyoruz. 
Ayrıca, sistem tarafından algılanan hücrelerin üzerindeki ortamdaki oksijen gradyanına dayalı olarak hipoksi, normoksi veya hiperoksi RPE kültürleri deneyiminin seviyesini tahmin etmek için çevrimiçi bir hesap makinesi de sağlıyoruz. Son olarak, bir PVR modelinde RPE hücrelerinin metabolik durumunu ölçmek ve RPE'nin metabolik olarak hipoksiye nasıl adapte olduğunu anlamak için sistemin iki uygulamasını gözden geçiriyoruz. Bu sistemin yüksek derecede polarize ve diferansiye RPE kültürlerinde kullanılmasının, hem fizyolojik hem de hastalık durumları altında RPE mitokondriyal metabolizması hakkındaki anlayışımızı artıracağını tahmin ediyoruz.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of functionally postmitotic, highly polarized epithelial cells that form a barrier between light-sensitive photoreceptors in the retina and their blood circulation, a capillary bed termed the choriocapillaris. Like the role of glia-supporting neurons, the RPE carries out myriad functions to support photoreceptors, including phagocytosis of photoreceptor outer segments, transport of nutrients and metabolic support for photoreceptors, and secretion of essential growth factors, all critical for maintaining visual function.
Degeneration of the RPE underlies several common degenerative disorders of vision. In age-related macular degeneration (AMD), one of the most common causes of incurable vision loss in the world, the RPE dies, and overlying photoreceptors therefore suffer a secondary degeneration. In proliferative vitreoretinopathy (PVR), the RPE instead exits its normally quiescent postmitotic state, proliferating and dedifferentiating into a mesenchymal state (a so-called epithelial-to-mesenchymal transition [EMT]) with alterations in its metabolism. RPE dedifferentiation causes a loss of RPE support to photoreceptors while also triggering a more fibrotic state. This results in both photoreceptor degeneration and RPE-induced scarring, both of which trigger vision loss1,2.
A major part of the RPE&#39;s support to photoreceptors is metabolic, and metabolic dysregulation is a critical factor in numerous retinal diseases, including AMD and PVR. The RPE serves as a regulatory barrier between photoreceptors and their source of oxygen and nutrients, the choriocapillaris. Thus, what the RPE chooses to metabolize versus what the RPE chooses to pass through from the choriocapillaris to the photoreceptors strongly governs photoreceptor metabolism and survival. Numerous studies have shown that the RPE is heavily dependent on mitochondrial metabolism for its normal health, and that photoreceptors instead rely heavily on glycolysis3. This has introduced the concept of complementary, intertwined metabolic states between photoreceptors and the RPE. Specifically, the RPE reduces its metabolism of preferred photoreceptor metabolic substrates and instead utilizes the byproducts of photoreceptor metabolism combined with the metabolites that photoreceptors do not consume. In diseases such as PVR and AMD, evidence strongly suggests that the RPE becomes more glycolytic and less dependent on mitochondrial metabolism; this shift towards RPE glycolysis may starve photoreceptors of metabolites it needs, triggering degeneration4,5,6. Given how interdependent RPE and photoreceptor metabolism are and how much altered metabolism underlies retinal disease, there is strong interest in modeling and manipulating RPE metabolism for therapeutic purposes.
While studying RPE mitochondrial metabolism in vivo is ideal, many aspects of RPE mitochondrial metabolism can only be practically probed in an in vitro culture system. Significant progress towards high-fidelity RPE cultures has been made in the past several decades, to the point that the most carefully groomed RPE cultures are now being used for cell replacement therapy in human clinical trials7. To maintain such high-fidelity cultures, the RPE needs to be grown on particular substrates in particular media for months prior to experimentation. With these conditions, RPE cultures are maximally differentiated and polarized, approximating in vivo RPE. Unfortunately, there is no equipment currently available that can measure mitochondrial metabolism specifically from the RPE in vivo. While oxygen monitoring of the retinal capillary network has been achieved in vivo using electron paramagnetic resonance (EPR) oximetry8, this is not possible for RPE analysis. Differences between RPE metabolism in vivo and in vitro are not well-described, but RPE cultures have been shown to have high mitochondrial activity, similar to RPE in vivo3,9, suggesting significant insight into RPE mitochondrial metabolism can be gained using high-fidelity RPE cultures.
As all mitochondrial metabolism leads to oxygen consumption, measuring RPE oxygen consumption rates (OCR) is a faithful proxy for mitochondrial metabolism. Measuring OCR in RPE cultures has been difficult, as the conditions that promote maximal RPE polarization and differentiation often preclude long-term accurate OCR measurements with currently available techniques, such as the Seahorse Analyzer. In this methods paper, a novel device, termed the Resipher (hereafter referred to as &#34;the system&#34;), is introduced, which allows continuous measurement of OCR over weeks in RPE grown under conditions that maximally promote polarization and differentiation. The ease with which OCR can be measured by this system in RPE culture conditions that maximally promote RPE differentiation and polarization is unique among existing OCR-measuring devices.
This paper provides tips and tricks for using the system with RPE cultures, followed by a demonstration of two particular applications. First, RPE EMT, mimicking PVR, is triggered by exposure to transforming growth factor-beta (TGF&#946;)1,10,11,12. The system is used to monitor how RPE metabolism evolves during the EMT process. Second, the role of hypoxia in RPE metabolism is explored using this system. Hypoxia is an important contributor to the pathogenesis of AMD, as the choriocapillaris thins with age13,14. Combining this system with hypoxia chambers allows one to model altered RPE mitochondrial metabolism with the subtle hypoxia that accompanies aging. Finally, an online calculator using Resipher data is introduced to allow one to determine whether RPE cultures are in hypoxic, normoxic, or hyperoxic conditions. Such information is critical for drawing any conclusions about RPE metabolism from in vitro RPE culture studies.

Yazar Spotlight: Resipher Kullanılarak Retina Pigment Epitelinde Genişletilmiş Oksijen Tüketimi Ölçümü

Yüksek Derecede Diferansiye ve Polarize Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Oksijen Tüketim Oranlarının Uzun Süreli İzlenmesi

Degeneration of the RPE, or retinal pigment epithelium, underlies many causes of vision loss. Mitochondrial dysfunction underlies this RPE degeneration in many cases. We can measure mitochondrial function by looking at oxygen consumption rates, or OCR.Here we introduce a new method for measuring OCR in the RPE. Thanks to the work from multiple labs, it's now well-established, the RPE requires mitochondrial activity to maintain its health and function. Research is now more focused on what nutrients the RPE preferentially uses, and if that changes under stress.Prior methods for assessing OCR in RPE have limitations. Either the RPE was grown in non-ideal conditions, or it could not be assessed over long periods of time. So measuring OCR in high fidelity cultures that maintain features in vivo is one of the main challenges.The method for monitoring OCR introduced in this manuscript enables us to measure OCR over a week while manipulating the RPE under multiple experimental challenges. This is all done while the RPE is in ideal culture conditions that allows it to mimic ideal RPE in vivo. Recipher is a novel device for long-term monitoring of oxygen consumption in cell cultures, such as retinal pigment epithelium.Unlike short-term methods like seahorse analyzer, recipher supports extended monitoring under standard conditions, enabling detailed bioenergetic profiling over weeks while preserving cell health.

Resipher deneyi için "sandviç" kurulumu Şekil 2A'da gösterilmiştir. 96 oyuklu plaka üzerindeki 3, 4, 9 ve 10 numaralı sütunlara karşılık gelen 32 problu algılama kapakları, hücre plakası ile Cihaz arasına oturur. Hub'a bağlandıktan sonra Cihaz, algılama kapağını yukarı ve aşağı hareket ettirmek için motorları etkinleştirir ve ortam kolonundaki O2 konsantrasyonunu hücre tek tabakasının üzerindeki bir yükseklik aralığında (tipik olarak 1-1,5 mm) ...

Retina pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde oksijen tüketim oranlarını (OCR) ölçmek için yeni bir cihaz sunuyoruz. Cihaz, plakalar standart bir hücre kültürü inkübatöründeyken standart hücre kültürü plakaları üzerinde standart ortamla büyütülen RPE üzerinde bir seferde haftalarca OCR'yi ölçebilir.

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

4.4K Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. RPE veya retina pigment epitelinin dejenerasyonu, görme kaybının birçok nedeninin temelini oluşturur. Mitokondriyal disfonksiyon birçok durumda bu RPE dejenerasyonunun temelini oluşturur. Mitokondriyal fonksiyonu oksijen tüketim oranlarına veya OCR'ye bakarak ölçebiliriz.Burada, RPE'de OCR'yi ölçmek için yeni bir yöntem sunuyoruz. Birden fazla laboratuvardan yapılan çalışmalar sayesinde, artık iyi kurulmuş olan RPE, sağlığını ...