A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

在我们的实验室中，我们专注于一种罕见的脑肿瘤，称为弥漫性低级别神经胶质瘤。这些神经胶质瘤通常会影响年轻人，它们的特征是称为 IDH-1 的基因突变。神经胶质瘤领域的主要进展是，首先，使用 3D 模型，如类肿瘤或类器官，其次，直接在神经胶质瘤移植的小鼠的大脑中使用成像，第三，使用特殊的转录组和单细胞 RNA。

当我们研究 IDH-1 突变神经胶质瘤时，我们面临的主要挑战是这些细胞的低增殖和它们在培养中难以维持，因此我们得出并定义了一个保持细胞存活的方案，对于其中一些细胞，我们已经能够衍生出一种细胞系， 但并非对所有患者都适用。通过在体外和体内研究 IDH-1 突变细胞，我们发现这些细胞具有很强的可塑性，它们可以采用两种细胞的命运，要么是星形胶质细胞样，要么是椭圆形，我们还发现轻推在这种可塑性中起着重要作用。通过这种新的外植体方案，我们已经能够在体外维持 IDH-1 突变细胞数周，但更多，数月，并且我们已经证明存在不同类型的肿瘤细胞，正如我们在患者中发现的那样。

我们还发现，有一些肿瘤环境细胞，如小胶质细胞，可以研究肿瘤细胞与其环境之间的相互作用，因此这些模型可以更准确地表示肿瘤中发现的生物多样性。首先，准备工作区并安排所有消毒工具。将肿瘤切除转移到冰上，以保持组织活力以进行培养。

检查肿瘤切除的大小和异质性。选择显示灰色且质地柔软或果冻状的部分，因为这些区域富含肿瘤细胞。将选定的肿瘤样品转移到 1.5 毫升微管或冷冻管中，并加入 1 毫升培养基。

使用无菌剪刀，将样品切成 1 到 2 立方毫米的小块。接下来，用无菌剪刀修剪 1， 000 微升移液器吸头的末端，形成一个直径约 3 至 4 毫米的宽开口。用切割尖端将 100 至 200 微升切碎的组织碎片移液到板的孔中。

轻轻地重新匀浆悬浮液以确保均匀分布，因为较小的片段往往会迅速沉降。将板放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 100% 湿度的培养箱中。如果肿瘤的代谢活动导致快速变黄或片段密度需要，请每天更换培养基。

首先，获得切碎的肿瘤组织悬液。对于冻存培养基制备，将 2 mL DMSO 添加到 8 mL 细胞培养基中。将一体积的切碎的肿瘤悬液与等体积的制备的 20% DMSO 冻存培养基混合。

小心地上下移液混合物，以确保充分混合。将冻存管快速转移到低温容器中，以促进逐渐降温，然后在零下 80 摄氏度下孵育过夜，然后转移到液氮中长期储存。解冻时，从液氮中取出冻存管，并立即将其置于 37 摄氏度的水浴中。

加热它们，直到大约 80% 的细胞解冻。要去除 DMSO，请快速将悬浮液转移到含有 5 mL 预热 1X PBS 的 15 mL 离心管中，并以 300 G 离心管 5 分钟。去除上清液并重复 PBS 洗涤，然后离心。

吸出上清液，确保沉淀不受干扰。将沉淀重悬于适量的培养基中，并将其转移到预包被的 PDL 层粘连蛋白 24 孔板中。在 37 摄氏度下孵育板。

在最短培养持续时间 4 周后，观察到表现出细长、双极或多极形态的细胞从附着在孔表面的肿瘤外植体中生长。在三种情况下，肿瘤来源的细胞在新鲜和冷冻保存的肿瘤之间表现出相当的形态，如形成复杂网络的细长和双极外观所示。可以清楚地观察到肿瘤来源的细胞沿纤维的径向迁移。

不成功的外植体培养显示非贴壁片段和大量 gitter 细胞，其特征是自发荧光和脂质含量。