A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

저희 연구실에서는 미만성 저등급 신경교종이라고 하는 희귀한 유형의 뇌종양에 초점을 맞춥니다. 이 신경교종은 종종 젊은 성인에게 영향을 미치며, IDH-1이라고 하는 유전자의 돌연변이가 특징입니다. 신경교종 분야의 주요 발전은 첫째, 튜모로이드 또는 오가노이드와 같은 3D 모델의 사용, 둘째, 신경교종으로 이식된 마우스의 뇌에서 직접 이미징 사용, 셋째, 특수 전사체 및 단세포 RNA의 사용입니다.

IDH-1 돌연변이 신경교종에 대해 연구할 때 직면하는 주요 과제는 이러한 세포의 증식이 낮고 배양에서 유지되기 어렵다는 것인데, 따라서 세포를 살아 있게 유지하기 위한 프로토콜을 도출하고 정의했으며, 그 중 일부의 경우 세포주를 도출할 수 있었습니다. 그러나 모든 환자에게 해당되는 것은 아닙니다. IDH-1 돌연변이 세포를 in vitro뿐만 아니라 in vivo에서도 연구함으로써 우리는 이 세포가 매우 가소성이며 성상세포와 유사하거나 타원형인 두 개의 세포의 운명을 채택할 수 있음을 발견했으며, 넛지가 이러한 가소성에서 중요한 역할을 한다는 것도 발견했습니다. 이 새로운 이식 프로토콜을 통해 우리는 IDH-1 돌연변이 세포를 몇 주 동안, 그러나 더 많은 달 동안 체외에서 유지할 수 있었으며, 환자에서 발견한 것처럼 다양한 유형의 종양 세포가 있음을 보여주었습니다.

우리는 또한 종양 세포와 환경 간의 상호 작용을 연구할 수 있는 미세아교세포와 같은 일부 종양 환경 세포가 있음을 발견했기 때문에 이러한 모델은 종양에서 발견되는 생물학적 다양성을 보다 정확하게 표현할 수 있습니다. 시작하려면 작업 공간을 준비하고 살균 된 모든 도구를 정리하십시오. 종양 절제술을 얼음 위에 옮겨 배양을 위한 조직 생존력을 보존합니다.

종양 절제술의 크기와 이질성을 검사합니다. 부드럽거나 젤리 같은 질감의 회색을 표시하는 부분을 선택하는데, 이 영역은 종양 세포가 풍부하기 때문입니다. 선택한 종양 샘플을 1.5ml 마이크로튜브 또는 cryovial로 옮기고 1ml의 배지를 추가합니다.

멸균 가위를 사용하여 샘플을 1-2입방밀리미터 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 다음으로, 멸균 가위로 1, 000 마이크로 리터 피펫 팁의 끝을 잘라 직경이 약 3-4 밀리미터인 넓은 구멍을 만듭니다. 100-200 마이크로 리터의 다진 조직 조각을 절단 된 팁으로 플레이트의 웰에 피펫팅합니다.

균일한 분포를 보장하기 위해 현탁액을 부드럽게 재균질화하면 더 작은 조각이 빠르게 침전되는 경향이 있습니다. 접시를 이산화탄소 37%와 습도 5%로 설정된 섭씨 100도로 설정된 인큐베이터에 넣습니다. 종양의 대사 활동으로 인해 급격한 황변이 발생하거나 단편 밀도가 필요한 경우 배지를 매일 교체하십시오.

시작하려면 다진 종양 조직 현탁액을 얻습니다. 동결 배지 준비의 경우 8ml의 세포 배양 배지에 2ml의 DMSO를 추가합니다. 한 부피의 다진 종양 현탁액과 동일한 부피의 준비된 20%DMSO 동결 배지를 결합합니다.

철저한 블렌딩을 보장하기 위해 혼합물을 위아래로 조심스럽게 피펫팅합니다. 점진적인 온도 감소를 용이하게 하기 위해 극저온 용기에 극저온 용기를 빠르게 옮긴 다음 섭씨 영하 80도에서 밤새 배양한 후 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다. 해동을 위해 액체 질소에서 극저온을 제거하고 즉시 섭씨 37도의 수조에 넣으십시오.

세포의 약 80%가 해동될 때까지 따뜻하게 합니다. DMSO를 제거하려면 5ml의 예열된 1X PBS가 들어 있는 15ml 원심분리기 튜브로 현탁액을 빠르게 옮기고 300G에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 PBS 세척을 반복한 다음 원심분리를 반복합니다.

상층액을 흡입하여 펠릿이 방해받지 않도록 합니다. 펠릿을 적절한 양의 배지에 재현탁시키고 사전 코팅된 PDL Laminin 24-well 플레이트로 옮깁니다. 접시를 섭씨 37도에서 배양합니다.

길쭉한 형태, 양극성 또는 다극성 형태를 나타내는 세포는 최소 4주의 배양 기간 후에 웰 표면에 부착된 종양 외식에서 성장하는 것이 관찰되었습니다. 종양 유래 세포는 3가지 사례에서 신선 종양과 냉동 보존 종양 간에 유사한 형태를 보였는데, 이는 복잡한 네트워크를 형성하는 길쭉한 양극성 외모에서 알 수 있듯이 나타났습니다. 섬유를 따라 종양 유래 세포의 방사상 이동이 명확하게 관찰되었습니다.

실패한 외식 배양에서는 비부착성 단편과 자가형광 및 지질 함량을 특징으로 하는 수많은 gitter 세포가 나타났습니다.