Nel nostro laboratorio, ci concentriamo sul raro tipo di tumori cerebrali che è chiamato gliomi diffusi di basso grado. Questi gliomi colpiscono spesso giovani adulti e sono caratterizzati da una mutazione nel gene chiamato IDH-1. I principali progressi nel campo dei gliomi sono, in primo luogo, l'uso di modelli 3D, come tumoridi o organoidi, in secondo luogo, l'uso dell'imaging direttamente nel cervello di topi trapiantati con gliomi e, in terzo luogo, l'uso di speciali RNA trascrittomici e a singola cellula.
La sfida principale che affrontiamo quando lavoriamo sui gliomi mutanti IDH-1 è la bassa proliferazione di queste cellule e la loro difficoltà di essere mantenute in coltura, e quindi abbiamo derivato e definito un protocollo per mantenere in vita le cellule, e per alcune di esse, siamo stati in grado di derivare una linea cellulare, ma non per tutti i pazienti. Studiando le cellule mutanti IDH-1 in vitro, ma anche in vivo, abbiamo scoperto che queste cellule sono piuttosto plastiche e possono adottare il destino di due cellule, sia simili agli astrociti che ovali, e abbiamo anche scoperto che il nudge sta giocando un ruolo importante in questa plasticità. Con questo nuovo protocollo di espianto, siamo stati in grado di mantenere le cellule mutanti IDH-1 in vitro per settimane, ma anche di più, per mesi, e abbiamo dimostrato che esistono diversi tipi di cellule tumorali, come abbiamo riscontrato nei pazienti.
Abbiamo anche scoperto che ci sono alcune cellule dell'ambiente tumorale, come le cellule microgliali, che rendono possibile studiare l'interazione tra le cellule tumorali e il loro ambiente, quindi questi modelli offrono una rappresentazione più accurata della diversità biologica trovata nei tumori. Per iniziare, prepara l'area di lavoro e disponi tutti gli strumenti sterilizzati. Trasferire la resezione del tumore su ghiaccio per preservare la vitalità dei tessuti per la coltura.
Esaminare la resezione del tumore per verificarne le dimensioni e l'eterogeneità. Seleziona le parti che mostrano un colore grigio con una consistenza morbida o gelatinosa, poiché queste aree sono ricche di cellule tumorali. Trasferire i campioni tumorali selezionati in una microprovetta da 1,5 millilitri o crioviale e aggiungere un millilitro di terreno.
Utilizzando le forbici sterili, tagliare i campioni in piccoli pezzi di uno o due millimetri cubi. Quindi, con le forbici sterili, tagliare l'estremità di un puntale per pipetta da 1.000 microlitri per creare un'ampia apertura di circa tre o quattro millimetri di diametro. Pipettare da 100 a 200 microlitri di frammenti di tessuto tritati con una punta tagliata nei pozzetti di una piastra.
Riomogeneizzare delicatamente la sospensione per garantire una distribuzione uniforme, poiché i frammenti più piccoli tendono a depositarsi rapidamente. Posizionare la piastra in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e il 100% di umidità. Sostituire quotidianamente il terreno se l'attività metabolica del tumore provoca un rapido ingiallimento o se la densità dei frammenti lo richiede.
Per iniziare, ottenere la sospensione di tessuto tumorale tritato. Per la preparazione del terreno di congelamento, aggiungere due millilitri di DMSO a otto millilitri di terreno di coltura cellulare. Combinare un volume della sospensione tumorale tritata con un volume uguale del mezzo di congelamento preparato al 20% di DMSO.
Pipettare con cura la miscela su e giù per garantire una miscelazione completa. Trasferire rapidamente i crioviali in un contenitore criogenico per facilitare la riduzione graduale della temperatura, quindi incubare durante la notte a meno 80 gradi Celsius prima di trasferirli in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Per lo scongelamento, rimuovere i crioviali dall'azoto liquido e metterli immediatamente in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Scaldali fino a quando circa l'80% delle cellule non si è scongelato. Per rimuovere il DMSO, trasferire rapidamente la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri contenente cinque millilitri di PBS 1X preriscaldato e centrifugare la provetta a 300 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e ripetere il lavaggio PBS, seguito dalla centrifugazione.
Aspirare il surnatante, assicurandosi che il pellet rimanga indisturbato. Risospendere il pellet in una quantità appropriata di terreno e trasferirlo in una piastra PDL Laminin prerivestita a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius.
È stato osservato che le cellule che presentano morfologie allungate, bipolari o multipolari crescono da espianti tumorali attaccati alla superficie del pozzetto dopo una durata minima della coltura di quattro settimane. Le cellule derivate dal tumore hanno mostrato una morfologia comparabile tra tumori freschi e crio-conservati in tre casi, come dimostrato dall'aspetto allungato e bipolare che forma reti intricate. La migrazione radiale della cellula derivata dal tumore lungo la fibra è stata chiaramente osservata.
Le colture di espianto, non riuscite, hanno mostrato frammenti non aderenti e numerose cellule gitter, caratterizzate da autofluorescenza e contenuto lipidico.
