我们实验室的研究重点是抗生素失败的原因。特别是，我们对细菌种群中少数被称为持久性细胞的细胞感兴趣，这些细胞据说会被抗生素杀死，但它们可以在抗生素治疗后存活。人们认为，这些持续存在会导致抗生素治疗结束后感染复发。
因此，我们有兴趣观察这些持久性的基因表达和代谢，以更好地了解它们的生存策略。持久化字段当前面临的挑战是平衡吞吐量和单个单元敏感性。我们需要匹配单个细胞在处理后的分裂能力，这将使它有资格成为持久性细胞，并提供一些可测量的表型，可以帮助我们了解细胞的内部运作。
我们可能必须对数千个 cells 执行此作，才能捕获哪怕一个 persister。与不精确的琼脂夹心法或微流控装置的制造相比，我们的协议易于实施，这在技术上可能具有挑战性。我们发现，随着时间的推移，我们的方案可以用最少的材料产生可重复和稳定的成像，这意味着它既具有成本效益，又对高质量数据收集的浪费最小。
我们未来的研究将结合使用组学和单细胞方法来研究病原体如何对不同类别的抗生素治疗做出反应并从中恢复。我们的最终目标是利用这种理解来开发改善临床感染治疗的新策略。首先，将无菌的 30 毫米盖玻片放入可互换盖玻片培养皿的不锈钢底座底部。
轻轻地将聚碳酸酯插件拧入底座，确保盖玻片形成腔室的底部，并通过压缩连接的硅胶 O 形圈将其密封到位。将定制的 3D 打印隔板放在 30 毫米的盖玻片上，以防止模态细胞交叉污染。使用所选培养基在 50 mL 锥形管中制备 1.5% 琼脂糖，然后轻轻旋转混合。
松开锥形管的盖子，将其放入玻璃烧杯或微波炉安全支架中。将琼脂糖混合物高温加热，每 3 到 4 秒停止旋转和混合，以防止起泡。一分钟后，检查混合物中是否残留任何未熔化的琼脂糖。
如果均匀透明，则让琼脂糖短暂冷却至 60 摄氏度左右。加入相关的抗生素或模具，轻轻旋转混合，避免形成气泡。用 30 毫米盖玻片将 2 毫升琼脂糖移液到腔室中。
轻轻地将无菌 25 毫米盖玻片放在顶部腔室开口的琼脂糖上。让垫子凝固一到两个小时。当垫凝固后，使用细尖永久性记号笔在 25 毫米盖玻片上标记每个样品的位置和身份。
倒置腔室，使不锈钢底环朝上，并在松开底座时小心地将聚碳酸酯插件固定在下方。将不锈钢底座放在一边。将 30 毫米盖玻片从琼脂糖垫上滑下并丢弃。
在 PBS 中将铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌细胞培养物稀释至适合可视化单细胞的稀疏密度。用力上下移液以均匀分布细胞。在琼脂糖垫上的标记位置点 5 微升稀释的细胞悬液。
斑点干燥后，将新的无菌 30 毫米盖玻片放在垫子上。然后用一只手握住聚碳酸酯插件，慢慢地将不锈钢底座重新穿在盖玻片上。腔室密封后，检查琼脂糖是否与 30 毫米盖玻片的表面接触。
使用镊子的钝端，轻轻按压 25 毫米的盖玻片，直到琼脂糖在其表面均匀地接触 30 毫米的盖玻片。首先，通过将载物台顶部培养箱和大室培养箱温度设置为 37 摄氏度来准备显微镜和成像室环境控制。接下来，打开腔室加湿器。
将一种琼脂糖垫制剂放入载物台顶部培养箱中，并关闭腔室以允许平衡。通过配置内置自动对焦算法以在多维采集期间使用相位通道，准备 MetaMorph 软件进行图像采集。在 Stage 选项卡中，为每个样品设置多个载物台位置，以细胞密度均匀分布的视野为目标。
然后在 Time-Lapse 选项卡中，配置图像采集的持续时间和频率。在 Wavelengths 选项卡中，设置所需的采集通道，并根据样品的信号强度调整曝光时间。琼脂糖垫在腔室中预热后，将加湿盖放在载物台顶部培养箱上。
接下来，在显微镜上，从相差模式切换到微分干涉对比模式。调整聚光镜和孔径光阑以获得适当的科勒照明。完成调整后，切换回相差模式。
导航到每个载物台位置，调整焦点并将载物台位置重置为新的焦平面。单击 Acquire 按钮开始多维采集。采集后，要编译图像，请打开 MetaMorph 并使用 Review Multidimensional Data 应用程序选择所需的通道或波长，并包括每个载物台位置的所有时间点。
单击 Load Images 并将每个编辑区及其各自的通道名称保存为 TIFF 文件。对金黄色葡萄球菌细胞进行延时成像，显示随着抗生素治疗的进行，碘化丙啶染色，这表明膜损伤。抗生素治疗期间铜绿假单胞菌成像显示细胞经历原生质球形成、丝状形成和细胞质浓缩，并伴有碘化丙啶染色。
成功的琼脂糖垫制备和成像条件能够观察到从抗生素治疗中恢复的金黄色葡萄球菌和从抗生素治疗中恢复的铜绿假单胞菌，以形成源自单细胞的大簇。
