La investigación de nuestro laboratorio se centra en por qué fracasan los antibióticos. En particular, estamos interesados en las pocas células llamadas persistentes en las poblaciones bacterianas que supuestamente van a ser eliminadas por el antibiótico, pero que pueden sobrevivir al tratamiento con antibióticos. Y se cree que estos síntomas persistentes hacen que las infecciones recaigan una vez finalizado el tratamiento con antibióticos.
Por lo tanto, estamos interesados en observar la expresión génica y el metabolismo de estos persistentes para comprender mejor sus estrategias de supervivencia. El desafío actual para el campo persistente es equilibrar el rendimiento con la sensibilidad de una sola celda. Necesitamos igualar la capacidad de una sola célula para dividirse después del tratamiento, lo que la calificará como persistente, con algún fenotipo medible que pueda ayudarnos a comprender el funcionamiento interno de la célula.
Y es posible que tengamos que hacer esto para que miles de células capturen incluso un solo persistente. Nuestro protocolo fue desarrollado para ser fácilmente implementado en comparación con los métodos imprecisos de sándwich de agar o la fabricación de dispositivos microfluídicos, que pueden ser técnicamente desafiantes. Descubrimos que nuestro protocolo produce imágenes reproducibles y estables a lo largo del tiempo con materiales mínimos, lo que significa que es rentable y genera un desperdicio mínimo para la recopilación de datos de calidad.
Nuestra investigación futura utilizará una combinación de ómicas y enfoques unicelulares para estudiar cómo los patógenos responden y se recuperan del tratamiento con diferentes clases de antibióticos. Nuestro objetivo final es aprovechar este conocimiento para desarrollar estrategias novedosas para mejorar el tratamiento de las infecciones clínicas. Para comenzar, coloque un cubreobjetos estéril de 30 milímetros en la parte inferior de la base de acero inoxidable de un plato deslizante intercambiable.
Enrosque suavemente el inserto de policarbonato en la base, asegurándose de que el cubreobjetos forme la base de la cámara y séllela en su lugar comprimiendo la junta tórica de silicona adjunta. Coloque un divisor personalizado impreso en 3D contra el cubreobjetos de 30 milímetros para evitar que las células modales se contaminen. Prepare 1,5% de agarosa en un tubo cónico de 50 mililitros utilizando el medio de su elección y revuelva suavemente para mezclar.
Afloje la tapa del tubo cónico y colóquelo en un vaso de precipitados de vidrio o en un soporte apto para microondas. Calienta la mezcla de agarosa en el microondas a temperatura alta, deteniéndose cada tres o cuatro segundos para girar y mezclar para evitar que burbujee. Después de un minuto, verifique si queda agarosa sin derretir en la mezcla.
Si está uniformemente despejado, deje que la agarosa se enfríe brevemente a unos 60 grados centígrados. Agregue los antibióticos o troqueles relevantes y revuelva suavemente para mezclar, evitando la formación de burbujas. Pipetear dos mililitros de agarosa en la cámara con el cubreobjetos de 30 milímetros.
Coloque suavemente un cubreobjetos estéril de 25 milímetros sobre la agarosa en la abertura superior de la cámara. Deje que la almohadilla se solidifique durante una o dos horas. Cuando la almohadilla esté solidificada, use un marcador permanente de punta fina para marcar las ubicaciones e identidades de cada muestra en el cubreobjetos de 25 milímetros.
Invierta la cámara de modo que el anillo de la base de acero inoxidable quede hacia arriba y sujete con cuidado el inserto de policarbonato por debajo mientras desenrosca la base. Deja la base de acero inoxidable a un lado. Deslice la cubierta de 30 milímetros de la almohadilla de agarosa y deséchela.
Diluir los cultivos celulares de Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus en PBS hasta obtener una densidad dispersa adecuada para la visualización de células individuales. Pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo para distribuir uniformemente las células. Localice cinco microlitros de las suspensiones celulares diluidas en los lugares marcados en la almohadilla de agarosa.
Una vez que las manchas estén secas, coloque una nueva cubierta estéril de 30 milímetros sobre la almohadilla. A continuación, sujete el inserto de policarbonato con una mano y vuelva a enhebrar lentamente la base de acero inoxidable sobre el cubreobjetos. Una vez que la cámara esté sellada, verifique si la agarosa está en contacto con la superficie del cubreobjetos de 30 milímetros.
Con el extremo romo de las pinzas, presione suavemente contra el cubreobjetos de 25 milímetros hasta que la agarosa toque el cubreobjetos de 30 milímetros de manera uniforme en su superficie. Para comenzar, prepare los controles ambientales del microscopio y la cámara de imágenes ajustando las temperaturas de la incubadora superior de la etapa y la incubadora de la cámara grande a 37 grados centígrados. A continuación, encienda el humidificador de cámara.
Coloque una almohadilla de preparación de agarosa en la incubadora superior de la etapa y cierre la cámara para permitir el equilibrio. Prepare el software MetaMorph para la adquisición de imágenes configurando el algoritmo de enfoque automático incorporado para utilizar el canal de fase durante la adquisición multidimensional. En la pestaña Etapa, defina varias posiciones de etapa para cada muestra, orientando los campos de visión con una densidad de celdas distribuida uniformemente.
A continuación, en la pestaña Time-Lapse, configure la duración y la frecuencia de la adquisición de imágenes. En la pestaña Longitudes de onda, establezca los canales deseados para la adquisición y ajuste los tiempos de exposición en función de la intensidad de la señal de la muestra. Una vez que la almohadilla de agarosa se haya calentado en la cámara, coloque la tapa humidificadora en la incubadora superior del escenario.
A continuación, en el microscopio, cambie del modo de contraste de fase al modo de contraste de interferencia diferencial. Ajuste el condensador y el diafragma de apertura para lograr una iluminación Kohler adecuada. Después de completar los ajustes, vuelva al modo de contraste de fase.
Desplácese a cada posición del escenario, ajuste el enfoque y restablezca la posición del escenario al nuevo plano focal. Haga clic en el botón Adquirir para iniciar la adquisición multidimensional. Después de la adquisición, para compilar imágenes, abra MetaMorph y use la aplicación Revisar datos multidimensionales para seleccionar los canales o longitudes de onda deseados e incluir todos los puntos de tiempo para cada posición del escenario.
Haga clic en Cargar imágenes y guarde cada compilación con su respectivo nombre de canal como un archivo TIFF. Se realizaron imágenes de lapso de tiempo de las células de Staphylococcus aureus que mostraron tinción de yoduro de propidio a medida que avanzaba el tratamiento con antibióticos, lo que indicó daño en la membrana. Las imágenes de Pseudomonas aeruginosa durante el tratamiento con antibióticos mostraron células que experimentan formación de esferoplastos, filamentación y condensación citoplasmática, acompañadas de tinción con yoduro de propidio.
El éxito de la preparación de la almohadilla de agarosa y las condiciones de imagen permitieron la observación de Staphylococcus aureus recuperándose del tratamiento con antibióticos y de Pseudomonas aeruginosa recuperándose del tratamiento con antibióticos para formar grandes grupos derivados de células individuales.
