这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。

第1部分：固定的胚胎<ol><li>填充与冰冷的DEPC - PBS清扫菜。置于冰上。打开用镊子轻敲壳蛋和删除壳件。 </li><li>用镊子取出厚厚的白蛋白。卵黄囊倾斜粗钳，使胚胎朝上。 </li><li>用剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。 </li><li>使用勺子，取出胚胎从卵黄和冰冷的DEPC - PBS。 </li><li>在显微镜下，删除膜和蛋黄，并转移到固定菜。 </li><li>牵制，除去DEPC - PBS。 DEPC - PBS在4％煤灰更换和修复O / N在4 ° C。 </li><li>删除固定液。更换与冰冷的DEPC - PBS。使用钝年底microcapillary针或显微切割刀，穿孔的神经系统和心腔，防止探头诱捕。 </li><li> 2X 10分钟DEPC - PBS洗0.1％Tween - 20的（PBT）的。脱水10分钟每25％，50％，75％甲醇在PBT。两次在100％甲醇脱水胚胎。在甲醇储存在-20 ° C。 </li></ol>第2部分：预杂交<ol><li>补充水分胚胎75％，50％和25％甲醇在PBT中的每个10分钟。在PBT洗净2X 10分钟。 </li><li>同时，准备冰冷的固定液（4％多聚甲醛在PBT）。替换蛋白酶K溶液（3毫升/瓶; [5克/毫升]最后在PBT）PBT。确保整个小瓶暴露蛋白酶K溶液轻轻滚动小瓶;故障排除的曝光时间。 </li><li>使用核糖核酸免费巴斯德吸管删除蛋白酶K，添加固色剂（2毫升）。整整20分钟，立即放在冰上。 </li><li>所有RT洗上nutator执行。洗2X 10分钟，在PBT和1x在PBT 10MN含有50％的杂交缓冲液。 </li><li>在杂交缓冲液清洗1X。孵育65 °彗星在4-5小时的杂交缓冲液2毫升。 </li></ol>第3部分：与探针的杂交胚胎<ol><li>挖掘和FITC耦合探针合成是在附录中描述。预计将提供一个强有力的信号探头，应synhesized FITC含核苷酸;较弱的探头应与辛含核苷酸合成。 </li><li> Prewarm探针在杂交缓冲液（500毫微克/毫升），使用2 ml小瓶。及时更换探头解决方案的杂交缓冲液。不要让胚胎干。孵育16小时，在65 ° C。 </li><li>替换探针杂交缓冲液，2洗，30分钟在65 ° C。在杂交缓冲液/ MABT中清洗15分钟（1 / 1 V / V /）在65 ° C。 </li></ol>第4部分：辛抗体孵育和显色反应<ol><li>洗净MABT 2X20万。在2％BBR / MABT清洗1小时。洗5小时，在2％BBR/20％HISS / MABT（封闭液）。孵育封闭液稀释1:2000辛抗体，O / N在4 °上nutator彗星。 </li><li>洗3X 10分钟在MABT，3X MABT每1小时。 </li><li>洗净NTMT 2X 20分钟。加入200ul NBT / BCIP底物10毫升NTMT。立即从小瓶NTMT和更换1-2毫升NBT / BCIP显缓冲区。在黑暗的地方。 20分钟后，显示器的色彩反应，并在此后每隔20分钟。 </li><li>显色反应（应该出现蓝色），在PBS洗10分钟，针用PBS填充的固定菜，并取代与4％的PBS PFA解决方案。修正/ O在4 ° C。 </li><li>转移到新的闪烁瓶中。 PBST洗涤（PBS 1％吐温20）2X10万。在MABT 2X 10分钟洗净。 </li><li>在63 ° C，在MABT 30分钟的孵育</li></ol>第5部分：FITC标记抗体孵育和显色反应<ol><li>洗2倍的MABT 10分钟，1小时2％，5小时的封闭液BBR / MABT </li><li>孵育在碱性磷酸酶偶联抗FITC抗体（1:500）的O / 4个N ° C。 </li><li>洗3X 10分钟在MABT，3X MABT每1小时。 </li><li>在TBS的pH值8.45与0.1％Tween - 20的（TBST）2X 20分钟洗净。 </li><li>准备在TBST使用试剂盒提供的试剂1,2和3的矢量红溶液（5毫升）。立即从小瓶TBST和替换矢量红缓冲区。在黑暗的地方。监控显色反应后40分钟，30分钟，其后每隔。 </li><li>下列颜色反应（应该会出现红色），将胚胎转移，以PBS。 </li></ol>第6部分：固定和加工<ol><li>转移到含PBS的固定菜，和4％PFA固定在室温或O / N为20分钟，在4 ° C。 </li><li>在PBS，2个10分钟洗净。摄影过程中，转移至20％甘油的PBS（这将使半透明的胚胎）。要创建一个会议厅，切2条PVC胶带，幻灯片上叠加。切方在使用刀片中心。去掉方使用产钳。 </li><li>蜡切片的过程中，转让，以PBS冲洗2X 10分钟，脱水甲醇梯度（25％，50％，75％和100％的PBS，每10分钟）。 </li><li>丙醇，3MN更换。 1,2,3,4 - 四氢更换，20分钟之后Histoclear（2个1小时）。更换histoclear /蜡1 / 1（V / V）60 ° C时为1小时。替换一个过程蜡为组织学。 </li></ol>第7部分：解决方案杂交缓冲液中，保存在-20 ° C的猎鹰，50毫升25毫升甲酰胺; 3.25毫升（20xSSC）; 0.5毫升（0.5M EDTA）; 1毫升（10％Tween - 20的）; 2.5毫升（1％SDS） 125 UL（20mg/ml tRNA的）; MABT 100ul（50毫克/毫升的肝素），准备100MM马来酸，pH值至7.5氢氧化钠颗粒。 150MM氯化钠和0.1％Tween - 20的。 NTMT（在使用前），50毫升：1毫升（5M氯化钠）; 2.5毫升（2M的Tris - HCl pH9.5）; 1.25毫升（2M氯化镁2）; 5毫升（10％Tween - 20的）。 TBST：0.1M的Tris - HCl，pH值8.45，0.15米，氯化钠0.1％Tween - 20的。 第8部分：故障排除<table border="1"><tbody><tr><th>问题</th><th>原因</th><th>补救</th></tr><tr><td valign="top">胚胎蜷缩</td><td valign="top">脱水/补液不足</td><td valign="top">维持在10分钟的间隔连续脱水/补液步骤</td></tr><tr><td valign="top">有没有探头的信号</td><td valign="top">探头是退化RNase的污染小瓶</td><td valign="top"> 1％琼脂糖凝胶上运行的探头确保整个小瓶蛋白酶K溶液暴露在第2步</td></tr><tr><td valign="top">探头是标签的心腔神经管</td><td valign="top">探头被困住</td><td valign="top">在第2步，确保所有空腔穿孔采用显微切割刀或microcapillary </td></tr><tr><td valign="top">胚胎解体以下杂交（步骤3） </td><td valign="top">蛋白酶K一步离开太久杂交温度过高</td><td valign="top">蛋白酶K不应该离开不再比1mn（阶段3和4），2分钟（第一阶段5至7），3分钟（8-10期），4分钟（第一阶段11-13）不要在 T O杂交更高超过摄氏65度</td></tr></tbody></table>第9部分：代表结果代表胚胎如下：（一）胚胎（阶段HH7），是标示与DIG - SOX探头（蓝色）和一个FITC -δ- 1的探头（红色）。 （二）胚胎（阶段HH8）都标有一挖，PAX6探头（蓝色）和FITC - SHH探头（红色）。 NF，神经倍，ANP，前神经板，PSM，presomitic中胚层，N，NT，脊索，神经管）。从博士实验室的探头礼物。 C.塔宾，古尔丁，D.恩里克，和J.布里斯科。 <img src="/files/ftp_upload/old/904_2008_10_20_1/904_Figure-01.png" alt="" width="303" height="300" />

<ol>
	<li>Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+neural+induction+by+FGF+signaling+before+gastrulation.">Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation.</a> Nature. 406, 74-78 (2000).</li><li>Rodr&#237;guez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpis&#250;a Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+Cer-like+protein+Caronte+mediates+the+establishment+of+embryonic+left-right+asymmetry.">The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry.</a> Nature. 401, 243-251 (1999).</li><li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen's+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li><li>Kawakami, M., Nakanishi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+an+endogenous+PKA+inhibitor,+PKIalpha,+in+organizing+left-right+axis+formation.">The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation.</a> Development. 128, 2509-2515 (2001).</li><li>Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7.">Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

2色整装原位杂交方法是用来确定空间和时间的基因表达模式，使用一个或两个基因的兴趣。应用领域包括新基因的基因表达模式的评估 （如1,2，以及以下侮辱基因表达的变化（3 胚胎操作 ，珠4，RNA 或DNA电构造5）。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles River </td>
<td>Premium Fertile</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereomicroscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>MZ9.5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Marsh Automatic Incubator</td>
<td>Tool</td>
<td>Lyon</td>
<td>RX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization Incubator</td>
<td>Tool</td>
<td>Hybaid</td>
<td>Micro-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adams Nutator orbital mixer</td>
<td>Tool</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps (1)</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72991-4C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14161-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spoon</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10370-18</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur Capillary Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70950-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcapillary tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1049-1PAK</td>
<td>Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps</td>
</tr>
<tr>
<td>Microdissecting knife</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10056-12</td>
<td>Use to puncture cavities prior to in situ hybridization</td>
</tr>
<tr>
<td>Minuten pins 0.2mm diam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>Keep pins together using a magnetic stirrer;</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>0001986475</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>Diethylpyrocarbonate (depc)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Acros Organics</td>
<td>10025025</td>
<td>Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave</td>
</tr>
<tr>
<td>16% PFA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1379-100ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2308-5MG</td>
<td>Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Formamide, deionized</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ambion</td>
<td>9342</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast tRNA-25 mg</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15401-011</td>
<td>Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium salt</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4784-250MG</td>
<td>Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.</td>
</tr>
<tr>
<td>SSC x20 pH5.5</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>PR-V4261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA (0.5M)</td>
<td>PR-V4231</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP166-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fluka</td>
<td>63189</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boehringer Blocking Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche Applied Sciences</td>
<td>11096176001</td>
<td>Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Heat inactivated sheep serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>013-000-121</td>
<td>Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche Applied Sciences</td>
<td>11093274910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NBT/BCIP stock solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche Applied Sciences</td>
<td>11681451001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche Applied Sciences</td>
<td>11426338910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2M Tris</td>
<td>BP1759-500</td>
<td>Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SK-5100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2,3,4-tetrahydronaphthalene</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>429325-100ML</td>
<td>Under hood</td>
</tr>		
</tbody>
</table>
</div>

double whole mount in situ hybridization of early chick embryos

鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，使其用于研究基因表达在脑，神经管，体节和心脏原基形成的理想工具。本视频演示了不同的步骤，在2色整装原位杂交;首先，胚胎从卵解剖和多聚甲醛固定。二，预杂交胚胎处理。具有两种不同的探针，再加上挖一个，并再加以FITC标记的杂交胚胎。杂交过夜后，胚胎培养与辛加上抗体。辛基板颜色反应的进行，和感兴趣的区域显示为蓝色。胚胎，然后加上与FITC标记抗体孵育。胚胎处理颜色用FITC反应，和感兴趣的区域显示为红色。最后，胚胎是固定的，为phtograph处理和切片。还介绍了故障排除指南。

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

本视频演示了原位杂交的方法，其中2个不同的基因的时空表达模式可以在年轻的鸡胚显示2色整装。这种方法最初是由大卫威尔金森，多明戈斯恩里克，菲尔英厄姆和大卫ISH - Horowicz。

双整装原位杂交技术在早期鸡胚

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

double-whole-mount-in-situ-hybridization-of-early-chick-embryos

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Biology

12.3K 次观看.  Institute of Biosciences and Technology - Texas A&M Health Science Center. 本视频演示了原位杂交的方法，其中2个不同的基因的时空表达模式可以在年轻的鸡胚显示2色整装。这种方法最初是由大卫威尔金森，多明戈斯恩里克，菲尔英厄姆和大卫ISH - Horowicz。