Gli anticorpi monoclonali (15.3B9, PAX7) sviluppato da (J. Dodd, TM Jessell e A. Kawakami) sono stati ottenuti dalla Banca dello Sviluppo Studi Ibridoma sviluppato sotto l&#39;egida del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Scienze biologiche , Iowa. DP è destinatario del Premio Ruth Kirschstein DA021977 1F32-01A1 dal National Institute on Drug Abuse. Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.

I. Panoramica schematica: Questo video mostra le diverse fasi in immunoistochimica montare tutto in embrione di pollo. In primo luogo, l&#39;embrione è fissato in PFA [IHC1]. Poi, l&#39;attività della perossidasi endogena si spegne [IHC2]. L&#39;embrione viene quindi incubato in anticorpo primario [IHC3]. Dopo numerosi lavaggi, l&#39;embrione viene incubato in anticorpo secondario [IHC4]; reazione del colore è rivelato utilizzando DAB [IHC5] e colorazione anticorpale sembra arancione [IHC6]. <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure 1.png" alt="Figura 1" width="600" height="573" /> Parte 1: fissaggio degli embrioni <ol><li> Per eseguire immunoistochimica intero montare su embrioni di pollo, per prima cosa aprire un uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere i pezzi del guscio. </li><li> Rimuovere l&#39;albumina spessore con una pinza, e inclinare il sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che l&#39;embrione verso l&#39;alto. </li><li> Utilizzando forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell&#39;embrione. Rimuovere l&#39;embrione dal tuorlo con un cucchiaio, e mettere in un piatto contenente PBS. </li><li> Sotto un microscopio dissezione, rimuovere con attenzione le membrane e il tuorlo e il trasferimento degli embrioni per un piatto fresco contenente PBS. </li><li> Perno l&#39;embrione giù con una pinza e perni di insetti, e aspirare il PBS. Sostituirlo con PFA 4% in PBS, e consentire l&#39;embrione di fissare 1 ora a temperatura ambiente. </li></ol> Parte 2: Preparazione di embrioni per la fase di anticorpi <ol><li> Per ridurre al minimo potenziale contaminazione microbica, utilizzare DDH 2 O in tutti i passaggi successivi. </li><li> Dopo che l&#39;embrione è fisso, aspirare la soluzione di fissativo e smaltire come rifiuto chimico. Riempire il piatto con PBS. </li><li> prossimo, con un coltello microdissezione, tagliare un quadrato attorno embrione per rimuovere membrane extraembrionali. Rimuovere le spine di insetti con una pinza. </li><li> Dopo i perni sono stati rimossi, utilizzare una pipetta Pasteur smussato fine di trasferire l&#39;embrione in una fiala contenente scintillazione con PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X). </li><li> Lavare l&#39;embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno. </li><li> Rimuovere PBT dal flaconcino scintillazione, e sostituirlo con PBTx contenenti 0,3% di H 2 O 2 al fine di inattivare perossidasi potenziale endogeno. </li><li> Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su nutator. </li><li> Lavare embrione con PBT, 3 volte per 10 minuti ciascuno, poi 3 volte per 30 minuti ciascuno. </li></ol> Parte 3: incubazione anticorpi <ol><li> Per colorare l&#39;embrione con l&#39;anticorpo, inizia lavando l&#39;embrione per un&#39;ora in tampone di bloccaggio o 1% BSA / 1% NGS / PBT (usiamo NGS perché l&#39;anticorpo secondario è sollevata in capra). Incubare su nutator per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Diluire l&#39;anticorpo primario 1:1 in tampone di bloccaggio, e incubare embrione in questa soluzione per 2 giorni a 4 ° C il nutator. Primario fattore di diluizione degli anticorpi dipende dalla scelta di anticorpo primario. Qui, usiamo un anticorpo dal Developmental Studies Ibridoma Banca, che viene fornito come supernatent. Noi diluirlo 1:1 in tampone di bloccaggio. </li><li> successiva, eseguire 3 10 minuti lava in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT. </li><li> Dopo il lavaggio, diluire l&#39;anticorpo secondario 1:2500 in tampone di bloccaggio (in questo caso coniugato perossidasi-capra anti-topo IgG (H + L), embrione e incubare in questa soluzione O / N a 4 ° C su nutator. </li><li> Eseguire 3 10 minuti di lavaggi in PBT, seguita da 3 1-ora lavaggi in PBT. </li></ol> Parte 3: reazione del colore <ol><li> Per sviluppare la reazione colore dell&#39;embrione macchiato, prima eseguire 2 20 minuti di lavaggi in tampone Tris (100mM Tris HCl, pH 7,4). </li><li> Nel frattempo sciogliere substrato DAB (3,3 &#39;-diaminobenzidina tetraidrocloruro) nel tampone Tris a 500μg/ml sotto cappa aspirante; tenere soluzione nel buio, sul ghiaccio. </li><li> Rimuovere ultimi tampone di lavaggio Tris dall&#39;embrione fiala contenente e sostituirlo con la soluzione DAB 5ml dal punto 3.2. Tenere in scuro su nutator per 20 mn. Smaltire Eppendorf punta nel secchio contenente una soluzione di candeggina al 10% per decontaminare DAB. </li><li> Nel frattempo preparare uno stock 0,3% H 2 O 2 in dh 2 O sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere il brodo di 50μl H 2 O 2 al flacone contenente gli embrioni in DAB. Tenere al buio. Dopo 1-2 minuti, monitorare la reazione al microscopio. </li></ol> Parte 4: embrioni per la fotografia e istologia <ol><li> Quando la reazione del colore è completa, smaltire DAB in secchio di candeggina. Sostituire con 5 ml di acqua del rubinetto. </li><li> Eseguire 2 10 minuti di lavaggi in PBS. </li><li> Al processo per la fotografia e sezionamento cera, disidratano in una serie di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%) per 10 minuti ciascuno. </li><li> Sostituire l&#39;etanolo da 0,5 - 1 ml di olio di cedro legno (questo renderà il traslucido embrione). Processo per la fotografia in olio di legno di cedro. </li><li> A seguito di fotografia, di ritorno embrione a fiala e sostituire l&#39;olio di legno di cedro con il 100% di etanolo. Ripetere il punto etanolo. </li><li> Sostituire ethanol con il 5% FCF veloce verde in 100% etanolo, e incubare per 3 minuti (questo passo renderà visibili gli embrioni per istologia). Sostituire rapida soluzione verde FCF con il 100% di etanolo e di processo per l&#39;esame istologico. </li></ol> Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="498" /> Negli esempi mostrati di seguito, gli embrioni vengono sezionati in fasi HH 10 (A), 12 (B) e 11 (C); Embrioni mostrano espressione di PAX 7 in emergenti Crestas neurali così come in somiti e del tubo neurale (A, B); In (C), notocorda è etichettato con 15.3B9 (Non-1) (Anticorpi fornite dal Developmental Studies Ibridoma Bank).

<ol>
	<li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system:+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord.">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li><li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+HGF/SF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen's+node+during+gastrulation.">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li><li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7.">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li><li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen's+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo.">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li></ol>

Questo video mostra le varie fasi di esecuzione di tutto il montaggio colorazione anticorpi in embrioni di pollo giovani. Questo protocollo è essenzialmente utilizzato per la caratterizzazione spaziale e temporale di anticorpi romanzo in pulcino 2,3, così come per l&#39;uso di marcatori antigenica nota per determinare malformazioni embrionali seguenti insulto 4.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eggs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River Laboratories</td>
<td>Premium Fertile</td>
<td>Fertilized, HH4 (16 hr)</td>
</tr>
<tr>
<td>Stereomicroscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Leica Microsystems</td>
<td>MZ9.5 or similar</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Marsh Automatic Incubator</td>
<td>Other</td>
<td>Lyon</td>
<td>RX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps (1)</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72991-4C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps (2)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11002-13</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14161-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> Plastic dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber Bulb</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur Capillary Pipette</td>
<td>Tool</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>70950-12</td>
<td>round edge under flame</td>
</tr>
<tr>
<td>Microdissecting knife</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>10056-12</td>
<td>Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>0001986475</td>
<td>Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C</td>
</tr>
<tr>
<td>16% PFA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% H2O2</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NGS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>005-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primary Antibodies</td>
<td>Reagent</td>
<td>Developmental studies Hybridoma Bank</td>
<td>4G11, 15.3B9, PAX7</td>
<td>For these antibodies, investgators used mouse donnors</td>
</tr>
<tr>
<td>Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>115-035-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3,3&#x2019;-diaminobenzidine tetrahydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce</td>
<td>34001</td>
<td>Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>Cedar wood oil</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>W522503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fast green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>F7252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minuten pins 0.2mm diam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for whole mount antibody staining in chick

L&#39;embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l&#39;espressione di anticorpi nello sviluppo del cervello, del tubo neurale e somite. Questo video mostra le diverse fasi, in tutto il montaggio colorazione anticorpale utilizzando anticorpi coniugati con HRP secondaria; In primo luogo, l&#39;embrione è sezionato dall&#39;uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, perossidasi endogena è inattivato; L&#39;embrione viene quindi esposto a anticorpo primario. Dopo numerosi lavaggi, l&#39;embrione viene incubato con l&#39;anticorpo secondario coniugato con HRP. Perossidasi viene rivelato tramite la reazione con il substrato diaminobenzidina. Infine, l&#39;embrione è fisso ed elaborati per la fotografia e sezionamento. Il vantaggio di questo metodo rispetto all&#39;uso di anticorpi fluorescenti è che gli embrioni possono essere trattati per sezionamento cera, permettendo così lo studio dei siti antigene nella sezione trasversale. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell<sup&gt; 1</sup&gt;.

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Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

method-for-whole-mount-antibody-staining-in-chick

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Views.  Texas A&M University (TAMU). Questo video dimostra tutta montare immunoistochimica, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale di un antigene può essere visualizzata in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da Jane e Tom Dodd Jessell.