Spinal Cord Elektrophysiologie

Zusammenfassung

Eine Demonstration der Isolierung von Neugeborenen Maus Rückenmark für elektrophysiologische Untersuchungen.

Zusammenfassung

Das Neugeborenen-Maus Rückenmark ist ein Modell für die Untersuchung der Entwicklung von neuronalen Schaltungen und Fortbewegung. Wir zeigen das Rückenmark Dissektion und Vorbereitung der Aufnahme Bad künstlichen Liquor des Bewegungsapparates Studien verwendet. Nachdem seziert, kann das Rückenmark ventral Nervenwurzeln, um eine Aufnahme Elektrode angebracht werden, um die elektrophysiologische Signale des zentralen Muster erzeugen Schaltung innerhalb Lendenmark aufzunehmen.

Protokoll

1. Bereiten künstlichen Liquor (aCSF) 1. Wir bereiten Sie zunächst einen 2 l einer 10-fach Bestand aCSF ohne Magnesium oder Calcium. Reagenzien in millimolaren aufgeführt. Katalog-Nummern beziehen sich auf Sigma / Aldrich.

2 Liter 10X aCSF (ohne Mg oder Ca)
Reagens	mM	g/2L	Katalog
KCl	40	5,96	P-9333
NaCl	1280	149,61	S-7653
NaHCO 3	210	35,28	S-6297
NaH 2 PO 4	5	1,38	S-9638
Glucose	300	108,12	D-9434
Destilliertem Wasser auf 2L

Außerdem bereiten wir 1M Lösungen von MgSO ₄ und CaCl ₂ in 50 mL Wasser, um Anpassungen in Molarität von Experiment zu Experiment zu ermöglichen und zu gewährleisten, das Kalzium in Lösung bleibt.

1M Calcium und Magnesium Stocks
Reagens	M	g/50mL	Katalog
CaCl 2	1	7,35	C-5080
MgSO 4	1	12,33	M-5921

Die aCSF Lösung muss mit Carbogen (95% O2 / 5% CO2) vergast werden, um den pH-Wert vor Zugabe von Calcium oder Calcium wird Niederschlag geringer.

1 Liter aCSF
Reagens	Volumen
10X aCSF	100ml
1M CaCl 2	1 mL (Sezieren) 2 ml (Aufnahme)
1M MgSO 4	1 mL
Fügen Sie ~ 800 ml destilliertem Wasser, Gas mit Carbogen für 2 Minuten, bevor die Zugabe von Calcium
Add destilliertem Wasser auf 1L.

Die Pumpen und Schläuche und seziert Gerichte sollten vor und nach Gebrauch abgespült werden.

Zergliederung

Während sezieren sollte 1mM Calcium aCSF kontinuierlich mit Carbogen begast werden. Die aCSF kann aus einer Flasche, die sezieren Gericht abgeschöpft werden und pumpte aus dem Sezieren Gericht auf die Flasche oder in den Abfall. Wir verwenden ein Elastomer (Sylgard, Dow Corning) beschichtet Gericht die Dissektion durchzuführen.

Das Neugeborenen-Maus ist schnell mit einer scharfen Schere und einen Schnitt mit der Schere durch den ventralen Thorax und Abdomen gemacht enthauptet. Das Tier wird dann ausgeweidet. Die ausgenommene Maus ist mit aCSF gespült. Das Tier wird dann mit dem Sezieren Gericht mit Insekten Stifte durch die Vorderbeine und an der Basis des Schwanzes eingefügt merken.

Die Wirbelsäule wird durch Ausführen einer ventralen Laminektomie entfernt. Die Wirbelsäule ist mit kleinen Zange gehalten und eine Klinge von kleinen Schere eingeführt wird unmittelbar dorsal der knöchernen Wirbelsäule. Die Lamina ist auf der einen Seite und dann die andere schneiden, während leichtes Anheben der knöchernen Wirbelsäule. Dies wird für die Länge der Wirbelsäule durchgeführt.

Das Rückenmark wird durch Schneiden auf beiden Seiten entlang des Rückenmarks auf die Nervenwurzeln zu trennen und schneiden den Hirnhäuten umgeben das Rückenmark entfernt. Wir schneiden auf der linken und rechten Seite, dann schneiden wir die Meningen an der Rückenseite des Rückenmarks um sie zu befreien. Die isolierte Kabel wird dann an das Gericht in der Nähe des aCSF Einlass gute Sauerstoffversorgung zu gewährleisten, wenn zusätzliche Tiere seziert werden merken.

Die isolierte Rückenmark ist dann eine Aufnahme Teller mit einem kleinen Löffel oder Spatel übertragen. Hier haben wir versorgen die Vorbereitung mit sauerstoffreichem 2mM Calcium aCSF. Das Rückenmark ist mit dem Elastomer beschichtet Schüssel und Mikromanipulatoren verwendet werden, um extrazelluläre, ganze Wurzel Saugelektroden in der Nähe der Wurzeln zu bewegen merken. Wenn die Spitze der Elektrode in der Nähe des freien root Ende ist, ist sanfte Saugwirkung angewendet an der Wurzel in die Saugelektrode ziehen. Dieser Vorgang kann wiederholt werden, um mehrere Wurzeln gleichzeitig aufgezeichnet werden.

Abbildung 1. Enthauptung und Ausweiden. A. Schnell enthaupten der Maus mit einer scharfen Schere. Mehr oder weniger Beiträge aus dem Hirnstamm erreicht in Abhängigkeit von der Höhe der geschnitten werden. B. Legen Sie ein Blatt der Schere in die Öffnung der Brusthöhle von der Enthauptung erstellt. Öffnen Sie das ventrale Thorax und Abdomen an der Basis des Schwanzes. Entfernen Sie die Eingeweide und gründlich mit aCSF.

Abbildung 2. Die Entfernung der Wirbelsäule. A. Setzen Sie die linke Blatt der Schere in den Raum zwischen der Wirbelsäule und des Rückenmarks auf der rechten Seite des Rückenmarks und Durchtrennung der Knochen über ventral am Kabel. Dann legen Sie die richtige Klinge der Schere in den Raum zwischen der Wirbelsäule und des Rückenmarks auf der linken Seite des Rückenmarks und geschnitten. B. Wiederholen Sie diesen Vorgang unter sanftem Zug auf die Wirbelsäule. Achten Sie darauf, Punktion des Rückenmarks, indem Sie die Schere in einem flachen Winkel.

Abbildung 3. Die Entfernung der Spinal Cord. A. Setzen Sie die linke Blatt der Schere in den Raum zwischen dem Rückenmark und die Knochen auf der rechten Seite des Rückenmarks und Durchtrennung der Wirbelsäule Wurzeln und Meningen über seitlich am Kabel. Dann legen Sie die richtige Klinge der Schere in den Raum zwischen dem Rückenmark und die Knochen auf der linken Seite des Rückenmarks und Durchtrennung der Wirbelsäule Wurzeln und Meningen Verlegung seitlich am Kabel. B. Schließlich heben die rostral Kabel und schneiden den Hirnhäuten Anschluss der Dorsalmark der Lamellen. Auch darauf achten, nicht zu durchstechen das Rückenmark, indem Sie die Schere in einem flachen Winkel. Schneiden Sie nicht die Wurzeln zu nahe an das Rückenmark.

Diskussion

Die isolierten neonatalen Rückenmark stellt eine gefügig Methode zur Untersuchung des Nervensystems Entwicklung1, 2. Im Lumbalmark der Neugeborenen-Nagetiere, kann central pattern Erzeugung Schaltung fiktiven Fortbewegung in Gegenwart von Neurotransmittern zu produzieren. Diese fiktive Lokomotion besteht aus rhythmischen Anstieg der Aktivität, Bursts, dass bei 0,2 bis 0,5 Hz erzeugt werden. Diese Ausbrüche sind so organisiert, links-rechts abwechselnd entlang der Länge des Kabels und der Beuger-Strecker Wechsel (ip...

Materialien

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
KCl			P-9333
NaCl			S-7653
NaHCO3			S-6297
NaH2PO4			S-9638
Glucose			D-9434
CaCl2			C-5080
MgSO4			M-5921
Large Scissors		Fine Science Tools	14070-12
Forceps		Fine Science Tools	11050-10
Fine Scissors		Fine Science Tools	15000-10
Insect pins		Fine Science Tools	26002-10
Sylgard 184 (Dow-Corning)
1L volumetric flask
100mL volumetric flask