Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Zusammenfassung

Whole Embryo Kultur Technik ermöglicht es uns, Kultur Maus und Ratte Embryonen Ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stufen. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte ganze Embryo Kultur nach E12.5 mit dem Rotor-Typ Flasche Kultur-System.

Zusammenfassung

Whole Embryo Culture (WEC) Technik hat im Jahr 1950 ist schon von New und seine Kollegen entwickelt und angewendet für Entwicklungsbiologie ^1. Obwohl die Entwicklung und das Wachstum von Säugetieren Embryonen hängt entscheidend von der Funktion der Plazenta sind, ermöglicht WEC Technik uns zur Kultur Maus und Ratte Embryonen ex vivo Zustand während begrenzter Zeiträume entsprechend midgestation Stadien während der embryonalen Tag (E) 6,5-E12.5 in der Maus oder E8.5-E14.5 in der Ratte ^{2, 3, 4.} In WEC, können wir direkt Bereichen von Embryonen mit feinen Glaskapillaren gewünschte Ziel, weil Embryonen unter dem Mikroskop manipuliert werden kann. Daher ist Nagetier WEC sehr nützliche Technik, wenn wir auf dynamische Entwicklungsprozesse postimplanted Säugerembryonen studieren wollen. Up to date, haben verschiedene Typen von WEC-Systeme bereits ¹ entwickelt. Unter denen ist die Rotor-Typ Flasche Kultursystem beliebtesten und eignet sich für langfristige Kultur der Embryonen midgestation, dh nach E9.5 und E11.5 in der Maus und Ratte, bzw. ^1. In diesem Video-Protokoll, demonstrieren wir unsere Standard-Verfahren der Ratte WEC nach E12.5 mit einem verfeinerten Modell der ursprünglichen Rotator System, das von Neu-und Cockroft ^{5, 6} entwickelt wurde, und stellen verschiedene Anwendungen der WEC-Technik für ein Studium in Säugetier-Entwicklung Biologie.

Protokoll

1. Einrichten des WEC-System

1. Joint ein 0,22 um Membranfilter mit dem Einlass Silikonschlauch im WEC-System ^a).
2. Öffnen Sie das Ventil einer Gasflasche mit O ₂ (95%) und CO ₂ (5%). Durchfluss des Gasgemisches in die Trommel über die sprudelnde Flasche mit Wasser autoklaviert.
3. Passen Sie den Volumenstrom des Gasgemisches zu 50 cc.
4. Legen Sie die aus lassen Silikonschlauch in eine Flasche Wasser und überprüfen Sie die Strömung von Gas-Gemisch.
5. Drehen Sie die Trommel mit einer Geschwindigkeit von 20 U / min.

2. Vorbereitung des Kulturmediums

1. Thaw Ratte sofort zentrifugiert (IC) Serum bei 37,0 ° C ^b). Add D-Glucose (2 mg / ml) in Serum aufgetaut in einer autoklavierten 100 ml Becher. Kulturmedium sollte in der primären Kultur Ebene (z. B. mit einer Kapuze) hergestellt werden.
2. Add Antibiotika-Antimykotikum (100X) Flüssigkeit, um das Serum mit 1: 400 Verdünnung.
3. Vaporize verbleibenden Isofluran (wegen Anästhesie von Ratten während der Blutentnahme) aus dem Serum für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) ^c).
4. Sterilisieren des Kulturmediums mit einem 0,45 um Membranfilter.
5. Gießen Sie 3,0 ml des Mediums in jeder Kultur Flasche und verschließen Sie oben auf jeder Flasche mit einem Silizium-Stecker, mit Alufolie abgedeckt (vgl. Rz. 14) ^d).
6. Bereiten Sie drei oder vier zur Verfügung Petrischalen mit Tyrode-Salzlösung ^e).

3. Anästhesie der Ratte und der Isolation der Gebärmutter

1. Anesthetize einer zeitlich trächtigen Ratten tief mit inhalativen oder parenterale Anästhetika.
2. Reinigen Sie den Bauchbereich des narkotisierten trächtigen Ratten mit 70% Ethanol.
3. Pick-up die Haut mit einer Pinzette und exteriorisieren der Bauchdecke, indem man die Haut mit großen Scheren ^f).
4. Pick-up die Bauchdecke mit einer Pinzette und machen U-förmigen großen Längsschnitten auf der Bauchdecke mit großen Scheren bis zur Brustwirbelsäule ^g).
5. Bär weg den Darm auf der linken Seite mit einer Pinzette und setzen Sie ein Ende des Uterus mit dem Eierstock.
6. Pick-up am Ende des Uterus mit einer Pinzette und schneiden Sie die Position zwischen der Gebärmutter und Eierstöcke mit großen Scheren.
7. Nehmen Sie die Gebärmutter von trächtigen Ratten, indem das Fett um die Gebärmutter bis zum anderen Ende der Gebärmutter.
8. Übertragen Sie die Gebärmutter auf eine Petrischale mit Tyrode-Salzlösung.
9. Euthanize der Ratte durch übermäßige Gabe von Anästhetika oder Genickbruch nach dem Entfernen der Gebärmutter.

4. Beseitigung von Embryonen aus der Gebärmutter

1. Kurz spülen die Gebärmutter in Tyrode-Salzlösung und überträgt es auf die zweite Petrischale mit einer feinen Pinzette ^h).
2. Unter einem Binokular, pick up der Gebärmutterwand mit einer feinen Pinzette und schneiden Sie die Gebärmutterwand an der gegenüberliegenden Seite der Mesometrium Verbindung mit Blutgefäßen mittels ophthalmologischen geraden Schere.
3. Legen Sie die Spitze des ophthalmologischen geraden Schere in den Raum zwischen der Gebärmutterwand und decidua. Cut der Gebärmutterwand längs der antimesometrial Seite.
4. Clump der Decidua am mesometrial Seite und separaten conceptuses aus der Gebärmutter mit zwei Paaren von feinen Pinzette ^i).
5. Transfer conceptuses zum dritten Petrischale mit einer sterilisierten Glaspipette mit einem geeigneten Durchmesser.

5. Präparation Rattenembryonen

1. Legen Sie eine Spitze der microforceps in die Dezidua und machen einen Querschnitt über die decidua rund um die Fruchtblase mit zwei Pinzetten.
2. Legen Sie die Spitzen der Pinzette in die Decidua an der Plazenta Seite und machen Sie zwei Längsschnitten auf der Decidua an die Spitze.
3. Entfernen Sie die Decidua an der Plazenta Seite durch Herausreißen, die mit zwei Pinzetten. Entfernen Sie die restlichen decidua mit zwei Pinzetten.
4. Pick up Reichert-Membran, machen ein horizontaler Schnitt auf sie, und trennen Sie die Membran von der Fruchtblase bei der Anti-Plazenta-Seite.
5. Machen Sie ein kleines Loch auf dem Dottersack in der Nähe des Kopfes des Embryos mit dem zwei Pinzetten, und schneiden Sie den Dottersack mit einem Paar von ophthalmologischen gebogene Schere. Es ist wichtig, nicht zu größeren Blutgefäße schädigen.
6. Pick-up das Amnion an der Stelle um den Kopf des Embryos mit den beiden Paaren von feinen Pinzette und ziehen Sie vorsichtig den Embryo aus dem Dottersack durch Zerreißen der Amnion ^h). Der Körper des Embryos sollte aus dem Dottersack gezogen werden, um die Sauerstoffversorgung für den Embryo im Stadium midgestation erhöhen.

6. Whole Embryo Kultur

1. Überprüfen Sie Schäden an der Plazenta, Dottersack, und der Zustand der Herzschlag und Blutkreislauf.
2. Im Bewusstsein der nicht Dehnen der Nabelschnur, Transferder Embryo zu einer Kultur-Flasche mit einem sterilisierten Glaspipette. Carry over von Tyrode-Salzlösung zur Kultur-Flaschen sollten so wenig wie möglich.
3. Entfernen Sie eine nicht-Loch-Silizium-Stecker aus der Rotator Trommel. Verbinden Sie die Kultur-Flasche mit einem Stopfen mit einem Loch für den Rotator Trommel der WEC-System senkrecht. Achten Sie darauf, nicht zu zwingen, auf die Trommel gelegt in ungeeigneten Richtungen, da der Rotor Trommel ist ein sehr feines Gerät. Die Flaschen mit den präparierten Embryonen sind zur Kultur einer nach dem anderen übertragen; Öffnung der Tür des Inkubators sollten minimiert werden, um die Temperatur des Inkubators vermeiden, ist zurückgegangen ^{j werden).}
4. Nach 10 h Kultur, erhöhen Sie den Volumenstrom des Gasgemisches bis zu 75 ccm und bis zu 100 ccm nach 24 h (Tabelle 1).
5. Das Kulturmedium sollte etwa 24 Stunden durch die Übertragung der kultivierten Embryonen in eine neue Kultur-Flasche mit frisch zubereiteten Medium gewechselt werden. Erhöhen Sie den Volumenstrom bis 125 ccm nach 34 Stunden und bis zu 150 ccm nach 48 h (Tabelle 1)
6. Überprüfen Sie gelegentlich den Zustand der kultivierten Embryonen durch Zählen Herzfrequenz (dh 120-150/min ist optimal) und durch Beobachtung die Durchblutung. Bei Bedarf zählen die Anzahl der Somiten, um das Wachstum der Embryonen in Tyrode-Salzlösung zu beurteilen. In der normalen Entwicklung ist eine Somiten in zwei Stunden zugegeben.
7. Wenn WEC abgeschlossen ist, stoppen Lieferung von Gas-Gemisch und ziehen Sie das Zuleitungsrohr und der Membranfilter zu vermeiden, zurück in das Zuleitungsrohr an der sprudelnden Flasche.

7. Hinweise

1. Die Temperatur im Inneren des WEC-System ist ständig auf 37,0-37,5 ° C gehalten
2. 100% Ratte IC Serum wird routinemäßig in unserer WEC für Ratten-und Mäuse-Embryonen verwendet werden, und bei -20 ° C vor dem Gebrauch.
3. Wir kaufen Ratte IC Serum, das von Ratten, die mit Isofluran gesammelt wird.
4. Einweg-Flaschen sind auch aus Ikemoto Rika zur Verfügung. Flaschen und Silikonstopfen sollten autoklaviert werden.
5. Dissection von Embryonen bei RT durchgeführt werden, da die Aufrechterhaltung von Embryonen bei niedrigen oder hohen Temperaturen während der Präparation spätere Entwicklung beeinflussen in WEC.
6. Werkzeuge für die Dissektion sind durch trockene Hitze sterilisiert.
7. Die Haut und Bauchwand getrennt geschnitten werden, um eine Kontamination der Haare in eine Schale wie möglich zu vermeiden. Wir wechseln ein paar große Schere und Pinzette mit einem neuen Paar von ihnen, wenn wir die Haut schneiden und zu isolieren, die Gebärmutter, bzw..
8. Mit einer Pinzette, deren Spitzen in Ordnung ist sehr wichtig für Gewebe sicher zu sezieren. Wir manuell schärfen den Spitzen der Pinzette mit einem Stein und Maschinenöl.
9. Wir verwenden eine Seite der Pinzette wie ein Messer, um Überdruck von Embryonen zu vermeiden.
10. Wenn die Temperatur im Inneren des WEC-System durch das Öffnen der Tür immer wieder abnimmt, arbeiten wir weiter an der Ampel links auf die Temperatur im Inneren des Systems zu halten.

8. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt Verfahren der Zerlegung des Rattenembryo und kultivierten Ratte Embryonen.

Abbildung 1. Whole Embryo Kultur der E12.5 Rattenembryo. (A) A conceptus aus der Gebärmutter der schwangeren Ratten seziert. (B) Entfernung von der Dezidua in der Plazenta Seite. (C) Entfernung von Reichert-Membran. (D) Eröffnung der Dottersack. (E) Die Rattenembryo Kultivierung in der Flasche für 6 Stunden nach Beginn der WEC. (F) Die Rattenembryo für 42 h kultiviert. d, decidua; R; Reichert-Membran, p, Plazenta, ys, Dottersack, e, Embryo.

	0 Std.	12 Stunden	24 Stunden	36 h	48 Stunden
E12.5 Rattenembryo	95% 50 cc	95% 75 ccm (10 h)	95% 100 cc	95% 125 ccm (34 hr)	95% 150 cc

Tabelle 1. Optimale Sauerstoff Zustand.

Diskussion

Es gibt zwei kritische Schritte in Nagetier WEC für den Erfolg. Erstens sollte die Dissektion Verfahren genau nicht zu beschädigen Embryonen, vor allem die Blutgefäße. Zweitens sollte das Verfahren so schnell wie möglich sein, da Sauerstoff und Nährstoffen nicht mehr versorgt werden über die Plazenta nach der Isolierung aus der Gebärmutter. Dies ist entscheidend für ältere Embryonen. Im Fall der Ratte WEC nach E12.5, sollten wir seziert Embryonen in Kultur-Flaschen Transfer innerhalb von 30 Minuten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Typ	Firma	Catalog Number	Kommentar
Einrichten WEC
WEC-System (10-0310)	Werkzeug	Ikemoto Rika	010-0310	Ein weiteres kleines Modell ist ebenfalls erhältlich.
Silicon-Stecker, ohne ein Loch	Werkzeug	Ikemoto Rika	010-032-08
Gas-Gemisch Zylinder	Werkzeug	Nikko Sanso	-	Mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid. Benutzerdefinierte Reihenfolge.
Gasregler	Werkzeug	Ono Seisakusho	WR-11
0,22 um Filter Millex GS	Werkzeug	Millipore	SLGS033SS
Anästhesie und Isolierung der Gebärmutter
Große Schere	Werkzeug	Napox	B-7H
Zange	Werkzeug	Napox	A-3-2
Entsorgung Petrischale (90 mm x 15 mm)	Werkzeug	Iwaki	SH90-15	Deep-Typ Gericht ist der beste für die Präparation.
Isofluran	Reagens	Abbott	B506	Für Anästhesie
Pentobarbital-Natrium	Reagens	Schering-Plough Animal Health	-	Für Anästhesie
Tyrode-Salzlösung	Reagens	-	-	Nach wie das Protokoll in Ref. 2. Sparen Sie bei 4 ° C.
Timed-trächtigen Sprague-Dawley Ratten	Tier	Charles Rivers Laboratories in Japan	-
Vorbereitung des Kulturmediums
Kultur Glasflasche	Werkzeug	Ikemoto Rika	010-032-05
Entsorgung Kultur Flasche	Werkzeug	Ikemoto Rika	010-032-06
Silicon-Stecker mit Loch	Werkzeug	Ikemoto Rika	010-032-07
Aluminiumfolie	Werkzeug	Jedes Unternehmen,	-
Autoklavieren Tasche	Werkzeug	Högy	HM-26	Für Kultur-Flaschen
Autoklavieren Tasche	Werkzeug	Högy	HM-14A	Für Silikonstopfen
0,45 um Filter Millex HA	Werkzeug	Millipore	SLHA033SS
50 ml konischen Rohr	Werkzeug	Becton Dickinson	352070
100 ml Becher	Werkzeug	Iwaki	TE-32
Rat IC Serum	Reagens	Charles Rivers Laboratories in Japan	-	Siehe: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336, Fax: +81- (0) 45-474-9340
D (+)-Glucose	Reagens	Wako	041-00595
Antibiotika-antimyotic Flüssigkeit	Reagens	Gibco	15240
Dissection von Embryonen
Ophthalmic gerade Schere	Werkzeug	Napox	MB50-7	Zum Schneiden der Gebärmutterwand
Ophthalmic gebogene Schere	Werkzeug	Napox	MB54-2	Zum Schneiden der Dottersack
Zange # 5	Werkzeug	Kraft	T6715
Zange # 5F	Werkzeug	Regine	T6819
Glaspipette	Werkzeug	-	-	Made by Hand mit Pasteurpipette.
Autoklavieren Tasche	Werkzeug	Högy	HM-4	Für Glas-Pipetten
Binokulares Mikroskop	Werkzeug	Leica	Mz7s
Licht	Werkzeug	Leica	CLS 150XD
Oil Stein	Werkzeug	Uchida Yoko	833-2000	Zum Schärfen der Zange
Maschinenöl	Werkzeug	Uchida Yoko	835-0000	Zum Schärfen der Zange