O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Resumo

Técnica de cultura todo embrião de rato permite-nos cultura e embriões de ratos Ex vivo Condição durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de cultura de embriões de ratos após toda E12.5 usando o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa.

Resumo

Todo embrião cultura técnica (WEC) foi desenvolvido em 1950 pela Nova e seus colegas, e aplicadas em biologia do desenvolvimento ^1. Embora o desenvolvimento e crescimento de embriões de mamíferos dependem criticamente a função da placenta, WEC técnica nos permite rato cultura e embriões de ratos condição de ex vivo durante períodos limitados, correspondendo a fases midgestation durante o dia embrionário (E) 6,5 E12.5 na mouse ou E8.5-E14.5 no rato ^{2, 3, 4.} No WEC, nós podemos diretamente alvo desejado áreas de embriões utilizando capilares de vidro fina porque os embriões podem ser manipulados sob o microscópio. Portanto, WEC roedores é uma técnica muito útil quando queremos estudar processos dinâmicos de desenvolvimento de embriões de mamíferos postimplanted. Até à data, vários tipos de sistemas têm sido desenvolvidos WEC ^1. Entre estes, o rotator-tipo de sistema de cultura de garrafa é mais popular e adequada para longo prazo de cultura de embriões em midgestation, ou seja, após E9.5 e E11.5 em camundongos e ratos, respectivamente ^1. Neste protocolo de vídeo, demonstramos nossos procedimentos padrão de WEC ratos após E12.5 usando um modelo refinado do sistema original rotador, que foi desenhado por New Cockroft e ^{5, 6,} e introduzir várias aplicações da técnica do CME para estudos em desenvolvimento de mamíferos biologia.

Protocolo

1. Configurando o sistema WEC

1. Conjunta de uma membrana M 0,22 filtro para o tubo de silicone de entrada no sistema ^{um WEC).}
2. Abrir a válvula de um cilindro de gás contendo O ₂ (95%) e CO ₂ (5%). Fluxo da mistura de gases no cilindro através da garrafa borbulhando contendo água esterilizada.
3. Ajustar o volume do fluxo de mistura gasosa a 50 cc.
4. Insira o tubo de silicone para deixar em uma garrafa de água e verificar o fluxo de mistura gasosa.
5. Girar o tambor com a velocidade de 20 rpm / min.

2. Preparação de meio de cultura

1. Rat-degelo imediatamente centrifugado (IC) de soro em 37,0 ° C ^b). Adicionar D-glicose (2 mg / ml) em soro descongeladas em um copo ml autoclavado 100. Meio de cultura deve ser preparado no nível de cultura primária (por exemplo, usando um capuz).
2. Adicionar antibióticos antimicótico líquido (100x) para o soro com 1: 400 de diluição.
3. Vaporize isoflurano restantes (devido à anestesia de ratos durante a coleta de sangue) do soro por 20 minutos em temperatura ambiente (RT) ^c).
4. Esterilizar o meio de cultura usando um filtro de membrana 0,45 mM.
5. Despeje 3,0 ml do meio em cada frasco de cultura e selar a parte superior de cada frasco com uma ficha de silício, coberta com folha de alumínio (ver ref. 14) ^d).
6. Prepare três ou quatro pratos disposição de Petri contendo solução salina ^e de ^Tyrode).

3. Anestesia do rato e do isolamento do útero

1. Anestesiar um rato timed-grávidas profundamente com anestésicos inalatórios ou parenteral.
2. Limpar a área abdominal do rato anestesiado grávida de etanol 70%.
3. Pick up a pele com uma pinça e exteriorizar a parede abdominal, cortando a pele com uma tesoura grande ^f).
4. Pick up da parede abdominal com um par de fórceps e fazer em forma de U grandes incisões longitudinal na parede abdominal com uma tesoura grande até o nível torácico ^g).
5. Arribar do intestino para o lado esquerdo com um par de fórceps e expor uma extremidade do útero ligado ao ovário.
6. Pegue o final do útero com uma pinça e corte a posição entre o útero e ovário com uma tesoura grande.
7. Tirar o útero de ratos fêmeas grávidas, cortando a gordura ao redor do útero até a outra extremidade do útero.
8. Transferência do útero para uma placa de Petri contendo solução salina de Tyrode.
9. Euthanize o rato por excesso de administração de anestésicos ou deslocamento cervical após a remoção do útero.

4. Remoção dos embriões do útero

1. Brevemente lavar o útero em solução salina Tyrode e transferi-lo para a segunda placa de Petri com um par de pinças finas ^h).
2. Sob um microscópio binocular, pegar a parede uterina com um par de pinças finas e cortar a parede uterina no lado oposto ao mesométrio conectar-se com os vasos sanguíneos usando uma tesoura oftálmica em linha reta.
3. Insira a ponta de uma tesoura oftálmica em linha reta no espaço entre a parede uterina e decídua. Cortar a parede uterina longitudinalmente ao longo do lado antimesometrial.
4. Moita a decidua no lado mesometrial e conceptos separado do útero através de dois pares de pinças finas ^i).
5. Transferência de conceptos à placa de Petri terceiro com uma pipeta de vidro esterilizados, com um diâmetro adequado.

5. Dissecação de embriões de ratos

1. Inserir uma ponta do micropinças na decídua e fazer uma incisão transversal na decídua em torno do concepto com dois pares de fórceps.
2. Inserir as pontas dos pinça na decídua no lado placentário e fazer duas incisões longitudinais na decídua até o topo.
3. Remova a decídua no lado placentário rasgando que com dois pares de fórceps. Remover o decidua restantes com dois pares de fórceps.
4. Pick up membrana de Reichert, faça uma incisão horizontal sobre o mesmo, e separar a membrana do concepto no lado anti-placentária.
5. Faça um pequeno furo no saco vitelino perto da cabeça do embrião com os dois pares de fórceps, e cortar o saco vitelino com uma tesoura oftálmica curvas. É importante para não danificar os vasos sanguíneos.
6. Pegue o âmnio no local em torno da cabeça do embrião com os dois pares de pinças finas, e retire com cuidado o embrião a partir do saco vitelino, rasgando o âmnio ^h). O corpo do embrião deve ser puxado para fora do saco vitelino para aumentar a oferta de oxigênio para o embrião no estágio midgestation.

6. Cultura de embriões todo

1. Verificar danos na placenta, saco vitelino, e da condição do coração batendo e circulação sanguínea.
2. Estar ciente de não esticar o cordão umbilical, a transferênciao embrião de um frasco de cultura com uma pipeta de vidro esterilizado. Reporte de solução salina Tyrode para garrafas de cultura deve ser o mínimo possível.
3. Remover um plug de silicone não-buraco do tambor rotador. Conectar o frasco de cultura com uma ficha com um buraco no tambor rotator do sistema WEC perpendicularmente. Tenha cuidado para não colocar força no tambor em direções inadequadas desde o drum rotador é um equipamento muito bem. Os frascos contendo o embrião dissecados são transferidos para a cultura, um por um; abertura da porta da frente da incubadora devem ser minimizados para evitar que a temperatura da incubadora é diminuída ^j).
4. Após 10 h de cultura, aumentar o volume de fluxo da mistura de gás de até 75 cc e até 100 cc após 24 h (Tabela 1).
5. O meio de cultura deve ser mudado em torno de 24 horas através da transferência dos embriões cultivados em uma garrafa nova cultura com o meio recém preparado. Aumentar o volume de fluxo de até 125 cc, depois de 34 horas e até 150 cc após 48 h (Tabela 1)
6. Ocasionalmente verificar a condição dos embriões cultivados contando taxa de batimentos cardíacos (ie, 120-150/min é ótima) e observando a circulação sanguínea. Se necessário contar o número de somitos para julgar o crescimento de embriões em solução salina de Tyrode. No desenvolvimento normal, um somito é adicionado em duas horas.
7. WEC quando estiver terminada, pare de alimentação de mistura de gás e desconectar o tubo de entrada eo filtro de membrana para evitar o refluxo para dentro do tubo de entrada da garrafa borbulhando.

7. Notas

1. A temperatura dentro do sistema WEC é constantemente mantido a 37,0-37,5 ° C.
2. 100% rat IC soro é utilizado rotineiramente em nosso WEC de embriões de rato e do rato, e mantidos a -20 ° C antes do uso.
3. Nós compramos rato IC soro, que é coletado de ratos que estão anestesiados com isoflurano.
4. Garrafas descartáveis ​​também estão disponíveis a partir de Ikemoto Rika. Garrafas e plugs de silicone devem ser autoclavados.
5. Dissecação de embriões devem ser realizados à temperatura ambiente porque a manutenção de embriões em temperatura baixa ou alta durante a dissecção afetam o desenvolvimento posterior no WEC.
6. Ferramentas para dissecção são esterilizados por calor seco.
7. A pele e parede abdominal devem ser cortados separadamente para evitar a contaminação dos cabelos em um prato possível. Mudamos um par de tesouras e pinças grandes com um novo par deles quando cortamos a pele e isolar o útero, respectivamente.
8. Utilizando uma pinça, cujas pontas são muito bem é muito importante para dissecar tecidos com certeza. Nós manualmente afiar as pontas de uma pinça com uma pedra e óleo de máquina.
9. Usamos um lado da pinça como uma faca para evitar excesso de pressão de embriões.
10. Quando a temperatura dentro do sistema WEC diminui, abrindo a porta repetidamente, continuamos a acender a luz para manter a temperatura dentro do sistema.

8. Resultados representativos

A Figura 1 mostra os procedimentos de dissecação do embrião de rato e embriões de ratos cultivadas.

Figura 1. Cultura de embriões Whole do embrião de rato E12.5. (A) A concepto dissecados do útero de ratos fêmeas grávidas. (B) Remoção da decídua no lado placenta. (C) remoção da membrana de Reichert. (D) Abertura do saco vitelino. (E) O cultivo de embriões de rato na garrafa durante 6 horas após o início do WEC. (F) O embrião de rato cultivadas por 42 hr. d, decidua; R; membrana de Reichert; p, placenta; ys, saco vitelino, e, embrião.

	0 hr	12 hr	24 hr	36 hr	48 horas
E12.5 embrião de rato	95% 50 cc	95% 75 cc (10 h)	95% 100 cc	95% 125 cc (34 hr)	95% a 150 cc

Tabela 1. Condições de oxigênio Optimal.

Discussão

Existem dois passos críticos no WEC roedores para o sucesso. Primeiro, o procedimento de dissecção deve ser preciso para não danificar embriões, especialmente os vasos sanguíneos. Segundo, o procedimento deve ser o mais rápido possível, porque o oxigênio e nutrientes não são mais fornecidos através da placenta após o isolamento do útero. Isto é crítico para os embriões mais velhos. No caso do WEC de ratos após E12.5, devemos transferir embriões dissecado em garrafas de cultura em 30 minutos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Tipo	Companhia	Número de catálogo	Comentário
Criação WEC
WEC sistema (10-0310)	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-0310	Um outro modelo pequeno também está disponível.
Silicon plug sem um buraco	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-08
Cilindro de mistura de gás	Ferramenta	Nikko Sanso	-	Contendo 95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%. Ordem feita sob encomenda.
Regulador de gás	Ferramenta	Ono Seisakusho	WR-11
0,22 mM filtro Millex GS	Ferramenta	Millipore	SLGS033SS
Anestesia e isolamento do útero
Tesouras grandes	Ferramenta	Napox	B-7H
Fórceps	Ferramenta	Napox	A-3-2
Prato disposição Petri (90 mm x 15 mm)	Ferramenta	Iwaki	SH90-15	Deep-tipo de prato é o melhor para dissecção.
Isoflurano	Reagente	Abbott	B506	Para anestesia
Pentobarbital sódico	Reagente	Schering-Plough Saúde Animal	-	Para anestesia
Tyrode de solução salina	Reagente	-	-	De acordo como o protocolo na Ref. 2. Salvar a 4 ° C.
Cronometrado grávidas de ratos Sprague-Dawley	Animal	Charles Rivers Laboratories Japão	-
Preparação de meio de cultura
Garrafa de vidro cultura	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-05
Frasco de cultura disposição	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-06
Silicon ficha com buraco	Ferramenta	Ikemoto Rika	010-032-07
Folha de alumínio	Ferramenta	Qualquer empresa	-
Saco de autoclave	Ferramenta	Hogy	HM-26	Para garrafas de cultura
Saco de autoclave	Ferramenta	Hogy	HM-14A	Para plugues de silicone
0,45 mM filtro Millex HA	Ferramenta	Millipore	SLHA033SS
50 tubo cônico ml	Ferramenta	Becton Dickinson	352070
100 ml copo	Ferramenta	Iwaki	TE-32
Rat IC soro	Reagente	Charles Rivers Laboratories Japão	-	Referem-se a: Sr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336; FAX: +81- (0) 45-474-9340
D (+)-Glicose	Reagente	Wako	041-00595
Antibióticos antimyotic líquido	Reagente	Gibco	15240
Dissecação de embriões
Tesoura oftálmica reta	Ferramenta	Napox	MB50-7	Para o corte da parede uterina
Tesoura oftálmica curvas	Ferramenta	Napox	MB54-2	Para cortar o saco vitelino
Fórceps # 5	Ferramenta	Vigor	T6715
Fórceps # 5F	Ferramenta	Regine	T6819
Pipeta de vidro	Ferramenta	-	-	Feito à mão usando pipeta Pasteur.
Saco de autoclave	Ferramenta	Hogy	HM-4	Para pipetas de vidro
Microscópio binocular	Ferramenta	Leica	Mz7s
Luz	Ferramenta	Leica	CLS 150XD
Óleo de pedra	Ferramenta	Yoko Uchida	833-2000	Para afiar de fórceps
Óleo de máquina	Ferramenta	Yoko Uchida	835-0000	Para afiar de fórceps