Eine Prellung Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Zusammenfassung

Ein Modell der Quetschung schweren Verletzungen des Rückenmarks beschrieben. Detaillierte präoperative, operative und postoperative Schritte beschrieben, um ein konsistentes Modell zu erhalten.

Zusammenfassung

Die translationale Potenzial neuartiger Behandlungen sollten bei schweren Verletzungen des Rückenmarks (SCI) Prellung Modelle untersucht werden. Eine detaillierte Methodik wird beschrieben, um ein konsistentes Modell der schweren SCI erhalten. Verwendung eines stereotaktischen Rahmen und computergesteuerte Impaktor ermöglicht die Erzeugung von reproduzierbaren Verletzungen. Hypothermie und Harnwegsinfektion erhebliche Herausforderungen in der postoperativen Phase. Eine sorgfältige Überwachung der Tiere mit tägliche Aufnahme und Blase Ausdruck ermöglicht die frühzeitige Erkennung von postoperativen Komplikationen. Die funktionellen Ergebnisse dieser Prellung Modell entsprechen Durchtrennung Modelle. Die Quetschung Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der beiden neuroprotektive und neuroregenerative Ansätze zu bewerten.

Einleitung

Wahl des geeigneten Modells Verletzung ist entscheidend für die präklinische Evaluierung neuer Behandlungen für Rückenmarksverletzungen (SCI). ^1,2,13 In einer aktuellen Umfrage von Ärzten und Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Neurotrauma Prellung Modell, um Hemisektion oder vollständige Durchtrennung Modelle Gegensatz wurde allgemein akzeptiert als klinisch relevant. ⁸ Diese Meinung auf der Beobachtung, dass die Mehrheit der Verletzungen des Rückenmarks beim Menschen in der Natur ist kontusive beruht. ¹⁰ Die Biologie der Prellung scheint auch anders zu sein Hemisektion oder Durchtrennung Modelle. Iseda ^11, et al. verglichen die Wirkung von intraspinal Chondroitinase ABC Injektion auf Neuroregeneration separat in Hemisektion und Prellung Modelle. ⁴ axonale Regeneration wurde in der neuronalen Brücke in Hemisektion beobachtet, nicht aber die Prellung SCI Gruppe. Die Hemisektion oder vollständige Durchtrennung Modelle auch Bedingungen schaffen, bekannt zu existieren nur in einer sehr kleinen Teil der clinical Umständen. Zum Beispiel haben mehrere Forscher Gerüst-basierte Interventionen zur Implantation verwendet in der Läsion Hohlraum nach Hemisektion oder vollständige Durchtrennung der Regeneration zu fördern. ⁶ Dieser Ansatz wird klinisch irrelevant, weil Schaffung eines Hohlraums innerhalb verletzte Rückenmark ist unpraktisch und wahrscheinlich unethisch.

Variabilität in der funktionellen Erholung bleibt eine große Herausforderung für die Prellung Modelle. ^5,12 Diese Variabilität kann durch den Einsatz von Computer-gesteuerten Impaktor und Stabilisierung der Wirbelsäule vor dem Aufprall für eine gleichmäßige Antrieb über das Rückenmark Volumen vor allem die ventral motorischen Bahnen minimiert werden . Anzumerken ist, dass Plastizität und Sicherheiten Beitrag von überlebenden Axone der vorherrschende Mechanismus der Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks ist werden. ¹ Daher auch geringfügige Änderungen in Technik Prellung kann deutlich unterschiedlichen Ergebnissen führen. Zu diesem Zweck haben wir entwickeltein Modell der schweren Verletzungen des Rückenmarks, die im Einklang Kontusionsvolumen und funktionelle Erholung vergleichbar mit Durchtrennung Modelle ergibt. Dieses Modell kann für die Untersuchung sowohl die Neuroprotektion und Neuroregeneration Strategien als Proof of Concept für die Wirksamkeit der Behandlung eingesetzt werden.

Protokoll

1. Vorbereitung Bevor Spinal Cord Injury

Die chirurgischen Instrumente für diese Prozedur erforderlich sind Skalpell, Pickups mit und ohne Zähne, hemostats, selbsthaltend Gurtstraffer, feine Spitze rongeurs, Nadel-Treiber, resorbierbaren Fäden, und die Haut Clip-Applikatoren. Andere chirurgische Versorgung erforderlich sind OP-Abdeckungen, steril Blätter für OP-Feld, Gaze Schwämme, Baumwolle-Applikatoren, und Metallfolie. Autoklaven werden die chirurgischen Instrumente und Zubehör vor der Operation. Verwenden Sie die einzelnen Satz von Instrumenten und Zubehör für ein Tier. Reinigen Sie den OP-Bereich und eine Vorrichtung (Impaktor, Lichtquelle, stereotaktischen Rahmen, Glasperlen Sterilisatoren und Heizkissen) mit Alkoholtupfer.

Öffnen Sie die OP-Abdeckungen und sterile Handschuhe, um das Operationsfeld sorgfältig Vermeidung von Kontaminationen drapieren. Öffnen Sie die einzelnen Instrumente steril und sorgfältig platzieren diejenigen in das OP-Feld. Decken Sie die Knöpfe und Griffe von the Gerät wahrscheinlich während des Verfahrens mit der sterilen Metallfolie benötigt. Schalten Sie die Glasperle Sterilisator, bereit zu sein für den Einsatz während des Verfahrens.

2. Vorbereitung der Tiere

Bringt die Ratten im Labor-Bereich einige Stunden vor dem eigentlichen Verfahren. Verwalten Schmerzmittel mindestens eine Stunde vor dem erwarteten Verfahren (typischerweise buprinorphine 1,5 ml von 0,006 mg / ml subkutan). Verwalten präoperative Antibiotika (in der Regel Baytril 4 mg / kg subkutan). Anesthetize die Ratten mit 90 mg / kg Ketamin und warten, bis es keine Zehen Prise Antwort. Ertasten Sie den prominentesten Dornfortsatz in der Brustwirbelsäule. Dieses Niveau entspricht typischerweise mit T10 Dornfortsatz. Markieren Sie den Ort der geplanten Ebene in Bezug auf T10. In unserem Labor führen wir eine T10 Verletzungen. Die folgende Erzählung beschreibt die Technik des T10 SCI. Shave a 3 cm x 6 cm Rechteck längs und zentriert bei T10 Ebene. Reinigen Sie die Haut dreimal with Betadine Lösung. Apply Augen Schmiermittel auf jedes Auge. Übertragen Sie die Ratte in einer komfortablen Position, um das Operationsfeld sorgfältig Vermeidung von Kontaminationen. Legen Sie eine rektale Temperatursonde, um die Kerntemperatur überwachen und passen Sie die Heizung entsprechend zu Tier Temperatur so normal (~ 37,5 ° C) zu halten. Decken Sie die Ratte mit einem Operationstuch mit einem Fenster über dem OP-Gebiet.

3. Chirurgische Vorgehensweise

Beginnen Sie mit einem ca. 4 cm langer Schnitt mit einem # 10 Klinge auf dem T10 Marke zentriert. Fahren Sie geduldig sezieren Faszie und Muskel Schichten weg von den T9-T11 Dornfortsätze und Plättchen. Zeigen Wundhaken, um Muskeln und Faszien Einfahren vom Knochen. Während die Stabilisierung der Dornfortsatz T9 scharf unterteilen die interspinalen Lig. zwischen T9 und T10 mit einer feinen Schere. Ebenso stabilisieren die T10 Dornfortsatz und teilen die interspinalen Band zwischen T10-T11. Verwenden Schleife Vergrößerung complete die Aufteilung der Bänder den ganzen Weg durch das Lig. flavum (Abbildung 1). Die Thekalsack ist leicht ersichtlich, wenn das Ligamentum flavum wird getrennt. Mit feiner Spitze rongeurs sorgfältig ausführen stückweise Laminektomie bilateral bei T10. Äußerste Sorgfalt wird angewendet, um einen Abwärtsdruck auf den Thekalsack und unbeabsichtigte Verletzungen von den rongeur Tipps vermeiden. Die Lamina und Dornfortsatz T10 vollständig entfernt wird.

Bewegen Sie das Tier in Position auf Stabilisierung Plattform. Verwenden Stabilisierung Klemmen, um die Wirbelsäule durch Spannen der lateralen Seite des T11 Wirbelkörper durch die seitlichen Partien der T9 Wirbelkörper gefolgt immobilisieren. Achten Sie darauf, um die Ratte in die Plattform zu komprimieren mit den stabilisierenden Schellen wie dieser Raum für Atembewegungen einschränken würde und fügen unerwünschten Stress das Tier. Nach der Sicherung der Wirbelsäule Einstellungen auf dem Computer-gesteuerten Impaktor überprüft. Wir verwenden in der Regel Impaktor Spitze von 3,0 mm bei einer spEED von 4 cm / s mit einer Tiefe von 2 mm und einer Verweilzeit von 0,3 sec. Verlängern Sie die Impaktor Spitze und absenken, bis es berührt nur die Oberfläche Schnur. Fahren Sie die Spitze und senken das Gerät 2 mm in Richtung der Oberfläche des Rückenmarks. Lassen Kolben bei 4 cm / sec bis schwere Prellung des Rückenmarks Verletzungen verursachen. Erreiche Blutstillung mit gerade genug Druck, um die Baumwolle-Spitze-Applikator in Position zu halten, wobei Sie darauf achten, keinen unnötigen Druck auf das Kabel zu schaffen. Naht Muskeln und Faszien Schichten mit einer Figur-8 Stich man aufpassen, nicht zu eng ziehen Sie die Verwendung von resorbierbaren Fäden. Schließen Sie die Haut mit einem Minimum von 2 kleinen Heftklammern, bis zu 4 oder 5 Klammern verwendet werden, wenn Teile der Einschnitt nach den ersten 2 oder 3 Klammern offen bleiben werden.

3. Post-Prozedur Pflege

Platz Ratten in einer warmen Umgebung von etwa 33-35 ° C für 24 Stunden nach der Operation. Dies bringt einen Inkubator (während sie bewusstlos sind) und einen beheizten Raum Käfig, sobald sie sich zu bewegen beginnen. Sobald Ratten sind voll awake, verwalten 5 ml Kochsalzlösung, 1,5 ml (0,006 mg / ml) von buprinorphine und 0,1 ml Baytril subkutan alle. Fahren Sie mit buprinorphine subkutan zweimal täglich für ersten 24-48 h und Baytril einmal täglich für 7 Tage. Blasen sollte manuell ausgedrückt werden dreimal täglich bis zur Rückkehr der Blasenfunktion (<2 ml Urin in den frühen Morgenstunden Ausdruck an 3 aufeinanderfolgenden Tagen). Auch Tiere sollten während dieser Zeit für eine Infektion (Blut im Urin, weißliche Farbe, oder üblen Geruch) überprüft werden, verminderte körperliche Aktivität oder Probleme mit der Wundheilung. Zur Feststellung der Infektion sollten mit einer erhöhten Dosierung (oder Re-Initiation) von Antibiotika in Abstimmung mit den örtlichen Tierärzten begegnet werden. Wiegen Ratten täglich beginnend am Tag nach der Operation, um ihre Genesung zu beurteilen.

Ergebnisse

Läsionsvolumen

Wir haben große und konsequente Läsion Volumina nach der oben beschriebenen Technik erhalten. Mit einem blauen Färbung Luxol schnell eine mittlere Läsion Volumen von 2,04 mm ³ (95% CI 1,9 bis 2,18) (n = 5 Tiere) erhalten wurde. Abbildung 2 zeigt die mittlere Läsionsvolumen mit einem Vertreter Färbung mit Luxol schnell blau durch die Läsion Epizentrum.

Functional Scores

Die Verhaltens-Noten ...

Diskussion

Mehrere neuartige Behandlungen wurden kürzlich frühen Versprechen im Bereich der SCI die Forschung gezeigt. ³ sorgfältige Auswertung dieser Behandlungen ist in klinisch relevanten Modell SCI wichtig, Strategien mit maximaler translationalen Potenzial auszuwählen. Ein Schema der Einstufung wurde vor kurzem entwickelt, um die Stärke der präklinischen Studien zu evaluieren. ⁹ Diese Regelung betont die Bedeutung der Verwendung von schweren Prellung Modell SCI. Hier beschreiben wir ein solches Mod...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer controlled impactor	Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor
Surgical instruments
Scissors	Fine Science Tools Inc	14094-11 or 14060-09
Forceps	Fine Science Tools Inc	11006-12 and 11027-12 or 11506-12
Hemostats	Fine Science Tools Inc	13009-12
Retractors	Fine Science Tools Inc	17011-10
Rongeurs	Fine Science Tools Inc	16020-14
Needle driver	Fine Science Tools Inc	12001-13
Stereotactic frame	Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems
Buprinorphine
Baytril	Bayer
Ketamine