Un modèle de contusion de graves lésions de la moelle épinière chez les rats

Résumé

Un modèle de contusion de la lésion médullaire sévère est décrite. Les étapes détaillées pré-opératoire, opératoires et post-opératoires sont décrits pour obtenir un modèle cohérent.

Résumé

Le potentiel de translation de nouveaux traitements devrait être étudiée dans de graves blessures à la moelle épinière (SCI) des modèles de contusions. Une méthodologie détaillée est décrite afin d'obtenir un modèle cohérent de graves SCI. Utilisation d'un cadre stéréotaxique et de frappe commandé par ordinateur permet la création d'un dommage reproductible. L'hypothermie et les infections des voies urinaires posent des défis importants dans la période post-opératoire. Une surveillance attentive des animaux avec l'enregistrement de poids quotidien et l'expression de la vessie permet la détection précoce des complications post-opératoires. Les résultats fonctionnels de ce modèle de contusion sont équivalentes aux modèles de transsection. Le modèle de contusion peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de deux approches neuroprotectrices et neurorégénérative.

Introduction

Choix du modèle de blessure appropriée est cruciale pour l'évaluation préclinique de nouveaux traitements pour les blessures de la moelle épinière (SCI). ^1,2,13 Dans un récent sondage de médecins et de scientifiques dans le domaine de modèle de contusion traumatisme neurologique, par opposition à hemisection ou modèles de section complète , a été universellement considéré comme cliniquement pertinente. ⁸ Cette opinion est fondée sur le constat que la majorité des blessures de la moelle épinière chez l'homme est contondant dans la nature. ¹⁰ La biologie de contusion semble également être différents des modèles de Hémisection ou résection. ¹¹ Iseda, et al. comparé l'effet de l'injection intra-rachidienne chondroitinase ABC sur neurorégénération séparément dans hemisection et modèles de contusions. ⁴ régénération axonale a été observée dans le pont neuronal dans hemisection mais pas le groupe SCI de contusion. Le hemisection ou modèles de section complète créent également des conditions connues pour exister que dans un très petit sous-ensemble de clinical circonstances. Par exemple, plusieurs chercheurs ont utilisé des interventions échafaudage à base d'implantation dans la cavité lésion après hemisection ou section complète pour favoriser la régénération. ⁶ Cette approche devient cliniquement pertinente parce que la création d'une cavité à l'intérieur de la moelle épinière lésée est irréaliste et probablement contraire à l'éthique.

La variabilité de la récupération fonctionnelle reste un défi majeur pour les modèles de contusions. ^5,12 Cette variabilité peut être minimisée par l'utilisation de l'impacteur contrôlé par ordinateur et à la stabilisation de la colonne vertébrale avant l'impact pour la livraison de force uniforme à travers le volume de la moelle épinière en particulier les des voies motrices ventrale situés . Il faut noter que la plasticité et la contribution de garanties de la part des axones survivants est le mécanisme prédominant de récupération après une lésion de la moelle épinière. ¹ variations conséquent, même mineures dans la technique de contusion peuvent donner des résultats très différents. À cette fin, nous avons développéun modèle de lésion de la moelle épinière sévère qui donne le volume de contusion cohérente et la récupération fonctionnelle comparable aux modèles de transsection. Ce modèle peut être utilisé pour étudier à la fois la neuroprotection et les stratégies de Neuroregeneration comme une preuve de concept de l'efficacité du traitement.

Protocole

1. Préparation avant la lésion de la moelle épinière

Les instruments chirurgicaux nécessaires à cette procédure sont scalpel, micros avec et sans dents, pinces hémostatiques, écarteurs autostatique, Rongeurs pointe fine, le conducteur de l'aiguille, les sutures absorbables et applicateurs de clips de la peau. D'autres fournitures chirurgicales requises sont draps chirurgicaux, draps stériles pour champ opératoire, des éponges de gaze, applicateurs coton-tip, et une feuille métallique. Autoclave des instruments chirurgicaux et des fournitures avant la chirurgie. Utilisez le jeu individuel d'instruments et de fournitures pour un animal. Nettoyez la zone et un appareil (impacteur, de source de lumière, cadre stéréotaxique, billes de verre stérilisateurs et coussins chauffants) avec tampons imbibés d'alcool chirurgical.

Ouvrez les draps chirurgicaux et utiliser des gants stériles pour draper le champ opératoire en évitant soigneusement de contamination. Ouvrez les instruments individuels stérile et placer soigneusement ceux dans le domaine chirurgical. Couvrir les boutons et les poignées de thAppareil d'électronique susceptible nécessaire au cours de la procédure avec la feuille métallique stérile. Mettre en marche la stérilisateur à billes de verre pour être prêt à l'emploi au cours de la procédure.

2. Préparation des animaux

Apportez les rats à la zone laboratoire quelques heures avant l'intervention réelle. Administrer des médicaments de la douleur d'au moins une heure avant la procédure prévue (généralement buprinorphine 1,5 ml de 0,006 mg / ml sous-cutanée). Administrer des antibiotiques préopératoires (typiquement Baytril 4 mg / kg sous-cutanée). Anesthésier les rats à l'aide de 90 mg / kg de kétamine et d'attendre jusqu'à ce qu'il n'y a pas de réponse toe-pincement. Palper l'apophyse épineuse plus important au niveau du rachis thoracique. Ce niveau correspond généralement à T10 apophyse épineuse. Marquez l'emplacement du niveau prévu par rapport à T10. Dans notre laboratoire, nous effectuons une blessure T10. Le récit qui suit décrit la technique de T10 SCI. Raser un cm x 6 cm rectangle 3 longitudinalement et centrée au niveau T10. Nettoyer la peau trois fois wisolution de Betadine ème. Appliquer du lubrifiant ophtalmique sur chaque œil. Transférez le rat dans une position confortable pour le champ opératoire en évitant soigneusement de contamination. Insérer une sonde de température rectale à surveiller la température d'âme et d'ajuster en conséquence le chauffage pour maintenir la température des animaux est proche de la normale (~ 37,5 ° C) que possible. Recouvrir le rat avec un champ opératoire avec une fenêtre au-dessus du site chirurgical.

3. Procédure chirurgicale

Commencez avec une participation d'environ 4 cm incision à l'aide d'une lame # 10 centré sur la marque T10. Passez à disséquer patiemment fascia et les couches musculaires loin des apophyses épineuses T9-T11 et limbes. Placez les rétracteurs de rétracter les muscles et fascia loin de l'os. Alors que la stabilisation de l'apophyse épineuse de T9 fortement diviser le ligament interépineux entre T9 et T10 à l'aide de ciseaux fins. De même stabiliser l'apophyse épineuse T10 et diviser le ligament interépineux entre T10-T11. Utilisez une lentille de grossissement à compléterontte la division des ligaments tout au long du ligament jaune (Figure 1). Le sac dural est évidente une fois le ligament jaune est débranché. Utilisez rongeurs de pointe fine pour effectuer soigneusement laminectomie fragmentaire bilatérale au T10. Le plus grand soin est pris pour éviter une pression à la baisse sur le sac dural et blessures involontaires des conseils de rongeur. La lame et apophyse épineuse de T10 est complètement enlevé.

Déplacez l'animal en position sur plate-forme de stabilisation. Utiliser des brides de stabilisation pour immobiliser la colonne vertébrale par serrage des faces latérales du corps vertébral T11 suivie par les aspects latéraux du corps vertébral T9. Veillez à ne pas comprimer le rat dans la plate-forme avec les pinces de stabilisation car cela restreindrait espace pour les mouvements respiratoires et ajouter du stress indésirable l'animal. Après avoir sécurisé les paramètres de la colonne vertébrale sur l'impacteur contrôlé par ordinateur sont vérifiés. Nous utilisons généralement pointe de frappe de 3,0 mm à une spEED de 4 cm / s avec une profondeur de 2 mm et un temps de séjour de 0,3 s. Etendre la pointe du pendule et l'abaisser jusqu'à ce qu'il touche la surface de la moelle. Rétracter la pointe et abaisser le dispositif de 2 mm vers la surface de la moelle épinière. Relâchez piston à 4 cm / s pour provoquer une contusion sévère blessure à la moelle épinière. Atteindre l'hémostase avec juste assez de pression pour maintenir l'applicateur coton-tige en place, en faisant attention de ne pas créer une pression inutile sur le cordon. muscle de suture et des couches de fascia avec un chiffre 8 point en faisant attention à ne pas tirer le trop serré par des sutures absorbables. Fermer la peau avec un minimum de 2 petites agrafes; jusqu'à 4 ou 5 agrafes peuvent être utilisés si une partie de l'incision restent ouvertes après les 2 ou 3 premières agrafes.

3. Soins post-procédure

Placer les rats dans un environnement chaleureux d'environ 33-35 ° C pendant 24 heures après la chirurgie. Cela implique un incubateur (alors qu'ils sont inconscients) et un espace de cage chauffée dès qu'ils commencent à bouger. Une fois que les rats sont entièrement awake, administrer 5 ml de solution saline, 1,5 ml (0,006 mg / ml) de buprinorphine, et 0,1 ml de Baytril tout sous-cutanée. Continuer avec buprinorphine voie sous-cutanée deux fois par jour pendant 24-48 premières heures et Baytril une fois par jour pendant 7 jours. Vessies doivent être exprimées manuellement trois fois par jour jusqu'au retour de la fonction vésicale (<2 ml d'urine dans l'expression du matin pendant 3 jours consécutifs). Les animaux doivent également être vérifiés durant cette période d'infection (sang dans les urines, la couleur blanchâtre, ou une mauvaise odeur), diminution de l'activité physique ou des problèmes de cicatrisation. Présence d'une infection doit être contré avec un dosage augmenté (ou ré-initiation) d'antibiotiques en consultation avec les vétérinaires locaux. Peser les rats commencent quotidien le lendemain de l'intervention pour évaluer leur récupération.

Résultats

Lésion Volume

Nous avons obtenu de grands volumes et cohérente des lésions en suivant la technique décrite ci-dessus. L'utilisation d'un Luxol rapide coloration au bleu un volume moyen de lésion de 2,04 mm ³ (CI 01.09 au 02.18 95%) (n = 5 animaux) a été obtenue. Figure 2 montre signifie volume de la lésion avec une coloration représentative en utilisant Luxol bleu rapide grâce à l'épicentre de la lésion.

Les scores f...

Discussion

Plusieurs nouveaux traitements ont récemment révélé prometteur dans le domaine de la recherche SCI. ³ évaluation minutieuse de ces traitements est essentielle dans le modèle cliniquement pertinent de la SCI à choisir des stratégies à fort potentiel de translation maximum. Un système de notation a été récemment mis au point pour évaluer la force des études précliniques. ⁹ Ce schéma a souligné l'importance d'utiliser le modèle de contusion sévère SCI. Nous décrivons ici ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer controlled impactor	Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor
Surgical instruments
Scissors	Fine Science Tools Inc	14094-11 or 14060-09
Forceps	Fine Science Tools Inc	11006-12 and 11027-12 or 11506-12
Hemostats	Fine Science Tools Inc	13009-12
Retractors	Fine Science Tools Inc	17011-10
Rongeurs	Fine Science Tools Inc	16020-14
Needle driver	Fine Science Tools Inc	12001-13
Stereotactic frame	Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems
Buprinorphine
Baytril	Bayer
Ketamine