Un modello Contusione di gravi lesioni del midollo spinale nei ratti

Riepilogo

Un modello contusione di gravi lesioni del midollo spinale è descritto. Fasi di pre-operatoria, operatoria e post-operatoria dettagliate sono descritte di ottenere un modello coerente.

Abstract

Il potenziale traslazionale di nuovi trattamenti deve essere esaminata a gravi lesioni del midollo spinale (SCI) modelli contusione. Una metodologia dettagliata è descritta di ottenere un modello consistente di grave SCI. Uso di un telaio stereotassico e simulazione controllato da computer consente la creazione di lesioni riproducibile. Ipotermia e infezioni delle vie urinarie rappresentano sfide significative nel periodo post-operatorio. Un attento monitoraggio di animali con la registrazione del peso giornaliero e di espressione della vescica permette per la diagnosi precoce delle complicanze post-operatorie. I risultati funzionali di questo modello contusione sono equivalenti ai modelli transection. Il modello contusione può essere utilizzata per valutare l'efficacia di entrambi gli approcci neuroprotettivi e neurorigenerativo.

Introduzione

Scelta di un adeguato modello di lesione è cruciale per la valutazione preclinica di nuovi trattamenti per le lesioni del midollo spinale (SCI). ^1,2,13 In una recente indagine di medici e scienziati nel campo del modello contusione neurotrauma, al contrario di emisezione o modelli completi transection , è stato universalmente accettato di essere clinicamente rilevante. ⁸ Il presente parere si basa sulla constatazione che la maggior parte delle lesioni del midollo spinale nell'uomo è contusivo in natura. ¹⁰ La biologia della contusione sembra anche essere diverso da emisezione o transection modelli. Iseda ^11, et al. confrontato l'effetto di intraspinal condroitinasi iniezione ABC il neuroregeneration separatamente nei modelli contusione emisezione e. ⁴ rigenerazione assonale è stato osservato nel ponte neuronale in emisezione ma non il gruppo SCI contusione. Il modelli completi transection emisezione o anche creare le condizioni noti presenti in solo un piccolo sottoinsieme di clcircostanze inical. Ad esempio, diversi ricercatori hanno impiegato interventi impalcatura a base per l'impianto nella cavità della lesione dopo emisezione o resezione completa per promuovere la rigenerazione. ⁶ Questo approccio diventa clinicamente irrilevante, perché la creazione di una cavità all'interno midollo spinale danneggiato è impraticabile e probabilmente immorale.

Variabilità nel recupero funzionale rimane una sfida importante per i modelli contusione. ^5,12 Questa variabilità può essere minimizzato con l'uso di urto e di stabilizzazione della colonna vertebrale computer controllati prima dell'impatto per la consegna vigore uniforme in tutto il volume del midollo spinale in particolare le vie motorie situati ventralmente . Si deve notare che la plasticità e il contributo collaterale da assoni sopravvissuti è il meccanismo predominante di recupero dopo la lesione del midollo spinale. ¹ variazioni Quindi anche minori in tecnica contusione possono produrre risultati molto diversi. A tal fine abbiamo sviluppatoun modello di gravi lesioni del midollo spinale da cui si ricava il volume contusione coerenti e recupero funzionale comparabile con i modelli transection. Questo modello può essere utilizzato per lo studio sia per la neuroprotezione e strategie neuroregeneration come prova di concetto per l'efficacia del trattamento.

Protocollo

1. Preparazione Prima di lesioni del midollo spinale

Gli strumenti chirurgici necessari per questa procedura sono bisturi, pickup con e senza denti, emostatiche, divaricatori auto di sostegno, multa rongeurs punta, driver aghi, suture riassorbibili, e la pelle applicatori di clip. Altre forniture chirurgiche necessarie sono teli chirurgici, lenzuola sterili per campo operatorio, spugne garza, applicatori di cotone-tip e lamina metallica. Autoclave gli strumenti chirurgici e le forniture prima della chirurgia. Utilizzare il set individuale di strumenti e forniture per un animale. Pulire l'area chirurgica e apparecchi (simulazione, fonte di luce, cornice stereotassica, perle di vetro sterilizzatori, e rilievi di riscaldamento) con cotone imbevuto di alcol.

Aprire i teli chirurgici e usare guanti sterili per coprire il campo chirurgico evitando accuratamente la contaminazione. Aprire i singoli strumenti sterilmente e posizionare con cura quelli nel campo chirurgico. Coprire le manopole e maniglie di secoloApparecchi e probabilmente necessario durante la procedura con la lamina metallica sterile. Accensione sulla sferetta sterilizzatore vetro per essere pronti per l'uso durante la procedura.

2. Preparazione degli animali

Portare i ratti alla zona laboratorio poche ore prima della procedura reale. Somministrare farmaci antidolorifici almeno un ora prima della procedura prevista (tipicamente buprinorphine 1,5 ml di 0,006 mg / ml per via sottocutanea). Somministrare antibiotici preoperatori (tipicamente Baytril 4 mg / kg per via sottocutanea). Anestetizzare i topi con 90 mg / kg di ketamina e aspettare fino a quando non vi è alcuna risposta in punta pizzico. Palpare il processo spinoso più prominente nella spina dorsale toracica. Questo livello corrisponde in genere con T10 processo spinoso. Segnare la posizione del livello previsto in relazione al T10. Nel nostro laboratorio eseguiamo una lesione T10. La narrazione segue descrive la tecnica del T10 SCI. Shave un cm x 6 cm rettangolo di 3 longitudinalmente e centrata a livello T10. Pulire la pelle tre volte wisoluzione di Betadine esimo. Applicare oftalmica lubrificante su ogni occhio. Trasferire il ratto in una posizione comoda per il campo chirurgico evitando accuratamente contaminazioni. Inserire una sonda di temperatura rettale per monitorare la temperatura interna e regolare il riscaldamento di conseguenza per mantenere la temperatura animale come vicino al normale (~ 37,5 ° C) come possibile. Coprire il ratto con un telo chirurgico con una finestra sopra il sito chirurgico.

3. Procedura chirurgica

Inizia con un approssimativo 4 centimetri incisione con una lama di 10 ° centrato sul marchio T10. Procedere a sezionare con pazienza fascia e strati muscolari lontano dalle T9-T11 processi spinosi e lamine. Posizionare divaricatori per ritrarre muscolo e fascia dall'osso. Mentre la stabilizzazione del processo spinoso di T9 nettamente dividere il legamento interspinoso tra T9 e T10 con le forbici sottili. Allo stesso modo stabilizzare il processo spinoso T10 e dividere il legamento interspinoso tra T10-T11. Utilizzare ingrandimento loop per complete la divisione dei legamenti tutto il percorso attraverso il legamento giallo (Figura 1). Il sacco durale è evidente una volta che il legamento giallo è scollegato. Utilizzare multa rongeurs punta per eseguire attentamente spicciolata laminectomia bilaterale a T10. Massima attenzione è presa per evitare una pressione al ribasso sul sacco durale e lesioni involontarie dalle punte rongeur. La lamina e il processo spinoso di T10 viene completamente rimosso.

Spostare l'animale in posizione sulla piattaforma di stabilizzazione. Utilizzare fascette stabilizzanti per immobilizzare la colonna vertebrale fissando gli aspetti laterali del corpo vertebrale T11 seguiti dagli aspetti laterali del corpo vertebrale T9. Fare attenzione a non comprimere il topo nella piattaforma con i morsetti di stabilizzazione poiché ciò limiterebbe lo spazio per i movimenti respiratori e aggiungere stress indesiderati l'animale. Dopo aver fissato le impostazioni della colonna vertebrale sul dispositivo di simulazione computerizzato vengono controllati. Usiamo tipicamente punta d'urto di 3,0 mm alla speed di 4 cm / s con una profondità di 2 mm ed un tempo di permanenza di 0,3 sec. Estendere la punta del pendolo e abbassarlo fino a che raggiunge la superficie del cavo. Ritrarre la punta e abbassare il dispositivo di due millimetri verso la superficie del midollo spinale. Rilasciare pistone dopo 4 cm / sec a causare gravi lesioni del midollo spinale contusione. Raggiungere emostasi utilizzando solo una pressione sufficiente a mantenere l'applicatore cotone-tip a posto, facendo attenzione a non creare alcuna pressione eccessiva sul cavo. Sutura muscolare e strati fascia con una figura-8 punti facendo attenzione a non tirare il troppo stretto con suture assorbibili. Chiudere la pelle con un minimo di 2 piccoli punti metallici, fino a 4 o 5 punti metallici possono essere utilizzati se le parti della incisione rimangono aperti dopo le prime 2 o 3 punti.

3. -Procedura di cure post

Luogo topi in un ambiente caldo di circa 33-35 ° C per 24 ore dopo l'intervento. Ciò comporta un incubatore (mentre sono inconsci) e uno spazio gabbia riscaldata una volta che iniziano a muoversi. Una volta che i ratti sono completamente awake, somministrare 5 ml di soluzione fisiologica, 1,5 ml (0.006 mg / ml) di buprinorphine, e 0,1 ml di Baytril tutti per via sottocutanea. Continuare con buprinorphine per via sottocutanea due volte al giorno per le prime 24-48 ore e Baytril una volta al giorno per 7 giorni. Vesciche dovrebbero essere espressi manualmente tre volte al giorno fino al ritorno della funzione vescicale (<2 ml di urina in espressione di mattina presto per 3 giorni consecutivi). Gli animali devono essere controllati in questo periodo per l'infezione (sangue nelle urine, di colore biancastro, o cattivo odore), ridotta attività fisica o di problemi con la guarigione della ferita. Presenza di infezione deve essere contrastata con un aumento del dosaggio (o ri-avvio) di antibiotici, in consultazione con i veterinari locali. Pesare i ratti cominciano quotidiano il giorno dopo l'intervento per valutare il loro recupero.

Risultati

Lesione del volume

Abbiamo ottenuto grandi volumi e coerente lesioni mediante seguendo la tecnica descritta sopra. Utilizzando un Luxol veloce colorazione blu un volume delle lesioni media di 2,04 mm ³ (95% CI 1,9-2,18) (n = 5 animali) è stato ottenuto. Figura 2 mostra significa volume della lesione con una colorazione rappresentante utilizzando Luxol blu veloce attraverso l'epicentro della lesione.

Funzionali punteggi

Discussione

Diversi nuovi trattamenti hanno recentemente mostrato risultati promettenti inizi nel campo della ricerca sulle lesioni spinali. ³ valutazione attenta di questi trattamenti è indispensabile clinicamente rilevante modello di SCI per selezionare le strategie con il massimo potenziale traslazionale. Uno schema di classificazione è stato recentemente sviluppato per valutare la forza di studi preclinici. ⁹ Questo schema ha sottolineato l'importanza di utilizzare modello contusione grave SCI. Qui s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer controlled impactor	Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor
Surgical instruments
Scissors	Fine Science Tools Inc	14094-11 or 14060-09
Forceps	Fine Science Tools Inc	11006-12 and 11027-12 or 11506-12
Hemostats	Fine Science Tools Inc	13009-12
Retractors	Fine Science Tools Inc	17011-10
Rongeurs	Fine Science Tools Inc	16020-14
Needle driver	Fine Science Tools Inc	12001-13
Stereotactic frame	Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems
Buprinorphine
Baytril	Bayer
Ketamine