Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Hier hat sich ein schrittweises Vorgehen für die effiziente Erzeugung telencephalen glutamatergen Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) beschrieben worden. Die Unterscheidung wird durch Brechen der menschlichen PSCs zu Klumpen, die sich rund um Aggregate zu bilden, wenn die Zellen in einer Suspensionskultur platziert initiiert. Die Aggregate werden dann in hESC Medium aus den Tagen 1-4 gewachsen für spontane Differenzierung zu ermöglichen. Während dieser Zeit haben die Zellen die Fähigkeit, einem der drei Keimblätter werden. Von Tag 5-8, werden die Zellen in einem neuronalen Induktionsmedium platziert, um sie in das neuronale Linie zu drücken. Um Tag 8 werden die Zellen erlaubt, auf Platten mit 6 Vertiefungen befestigen und differenzieren während welcher Zeit die Neuroepithelzellen Form. Diese Neuroepithelzellen kann am Tag 17 isoliert werden. Die Zellen können dann als Neurosphären gehalten werden, bis sie bereit sind, auf Deckgläser plattiert werden. Verwendung eines basischen Medium ohne Faktoren caudalizing sind Neuroepithelzellen specified in telencephalen Vorstufen, die dann weiter in dorsale telencephalen Progenitoren und glutamatergen Neuronen effizient differenziert werden kann. Insgesamt bietet unserem System ein Werkzeug für die menschliche glutamatergen Neuronen für Forscher erzeugen, um die Entwicklung dieser Neuronen und der Krankheiten, die sie betreffen, zu studieren.

Einleitung

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSCs), einschließlich der beiden humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), haben die Fähigkeit, jeden Zelltyp des Körpers, einschließlich Neuronen ^1-3 generieren. Gerichteten Differenzierung verschiedener neuronaler Subtypen aus humanen PSCs hält den Schlüssel für die Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin. Die Erzeugung von funktionellen neuronalen Subtypen während der Entwicklung ist ein komplexer Prozess, der die Induktion der neuronale Linie, die Spezifikation des regionalen Progenitoren entlang der rostro-kaudalen Achse und die Differenzierung von post-mitotischen Neuronen Typen aus den regionalen Progenitoren ^4,5. Beginnend im Jahr 2001 wurden mehrere Systeme eingerichtet, um neuronale Linie von hES-Zellen, die eine Plattform zur Verfügung gestellt haben für die nachfolgende Generation von neuronalen Subtypen ^6,7 generieren. Basierend auf Entwicklungsprinzipien, mehrere Neuronen-Typen wie spinalen motorischen Neuronen ^8-12, Mittelhirn dopaminerge Neuronen ^13-15, und neuronale Zellen der Netzhaut ^16,17 wurden effizient von Mensch PSCs angegeben. Dies wurde durch die Anwendung kritischen Morphogene, die wichtig sind für die Spezifikation von diesen Neuronen-Typen während in vivo Entwicklung getan. Andere Protokolle sind auch entwickelt worden, um die Differenzierung zu Neuronen hESCs Verwendung von entweder ^{18 bis 20} zusätzliche Faktoren wie kleine Moleküle oder durch Co-Kultivierung mit anderen Zelltypen, um Differenzierung fördern ²¹ fördern.

Die menschlichen Neokortex ist hoch entwickelt und enthält viele Zelltypen, einschließlich glutamatergen Neuronen, die eine wichtige Rolle beim Lernen, Gedächtnis und kognitive Funktion ^22,23 spielen. Der erste Schritt beim Erzeugen glutamatergen Neuronen in Kultur zu telencephalen Vorläuferzellen angeben. Yoshiki Sasai der Gruppe erstmals über die gerichtete Differenzierung von Vorläufern von Maus telencephalen WSR (mESCs) unter Verwendung eines serumfreien suspension Kultur in Gegenwart DKK1 (was hemmt Wnt-Signalisierung) sowie LeftyA (die Signalisierung hemmt nodalen) ^24. Anschließend wurden mehrere Gruppen einschließlich Siemens auch die Spezifikation telencephalen Vorstufen aus menschlichem PSCs in serumfreiem Medium ^25-27 berichtet. Die Erzeugung von telencephalen Vorstufen aus menschlichem PSCs erfordert nicht die Verwendung von exogenen Morphogene und die Effizienz bei der Erzeugung dieser Vorstufen ist viel höher als die aus mESCs ^26,27. Hier hat sich ein chemisch definiertes System zur Induktion neuronalen die gut an Zhangs Gruppe ⁷ wurde festgestellt, beschrieben worden. Ohne den Zusatz von exogenen caudalizing Faktoren, dieses Protokoll effizient generiert telencephalen Vorstufen aus menschlichen PSCs ^27. Diese Vorläuferzellen können dann in dorsalen oder ventralen Vorläuferzellen durch die Regelung der Signalisierung von Wnt-und Sonic-Hedgehog (SHH) unterschieden werden. Die dorsalen Vorläuferzellen können weiter in glutamatergen Neuronen e unterscheidenfficiently ^27. Zusätzlich dieses Protokoll funktioniert auch gut für die Erzeugung von glutamatergen Neuronen aus menschlichem IPSCs ^28, die zur Erzeugung von patientenspezifischer Neuronen, die verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus sowie mögliche Therapien für eine große Reihe von Krankheiten zu erforschen ueber ermöglicht . Außerdem ist unser System bietet auch eine Plattform für die Entwicklung und Spezifikation der verschiedenen neuronalen Typen im Telencephalon erkunden.

Protokoll

Ein. Generierung von humanen pluripotenten Stammzellen Aggregate (D1-D4)

1. Menschlichen pluripotenten Stammzellen sind auf embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) Abzweige in Gegenwart von HES-Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml) kultiviert. Nach 5-7 Tagen in Kultur, wenn die Kolonien groß aber noch undifferenzierten sind, sind sie bereit für den nächsten Schritt.
2. Das Enzym Lösung sollte zunächst vorbereitet werden. In einem 50 ml-Röhrchen, löst den Dispase (oder Collagenase) bei einer 1 mg / ml-Konzentration in DMEM/F12 Medium. Da diese Lösungen zu mischen besten, wenn erwärmt, das Reagenzglas mit dem Medium und Enzym in einer 37 ° C heißen Wasserbad für 10 bis 15 min und dann unter Verwendung eines sterilisieren Steriflip Filter.
3. Absaugen das Medium aus den Zellen, spülen Sie sie mit DMEM/F12, und saugen diese ebenfalls ausgeschaltet werden. 1 ml Dispase in jede Vertiefung und in den Inkubator für 3-5 min für hESCs (bis zu 10 min für iPS). Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop; wenndie Kanten zu wellen leicht / sehen ein bisschen dunkler, sind die Zellen bereit für den nächsten Schritt. Es ist am besten, um die Zellen nach 3 min zu überprüfen und setzen Sie sie wieder ein, wenn nötig. Bei Verwendung dieses Protokolls zum ersten Mal ist es empfehlenswert, mit nur einer Platte von Zellen zu einer Zeit zu starten, da es wichtig ist, die Zellen aus dem Dispase so schnell wie möglich zu entfernen.
4. Absaugen die Dispase aus den Zellen. Gently (die Zellen sind sehr anfällig in dieser Phase und kommen weg von der Platte relativ leicht) 1,5 ml DMEM/F12-Medium in jede Vertiefung, um abspülen Dispase. Absaugen die DMEM/F12 und fügen Sie 1,5 ml hESC Medium in jede Vertiefung.
5. Zu lösen und die Zellen aufzubrechen, legen Sie die Spitze einer 10 ml Glaspipette in Richtung der unteren rechten Ecke eines gut (Berührung der Zellen) und bewegen Sie die Pipette nach oben und unten (vertikal) - die oben stoke sollte in der Nähe sein, dem Verfahren Abwärtsbewegung. Sobald die andere Seite der Wanne erreicht ist, in der horizontalen erzei wiederholenktion.
6. Sobald alle Zellen in Suspension sind, legen Sie sie in 15 ml-Tuben und zentrifugieren bei 200 xg für 2 min. Es sollte ein Pellet von Zellen am Boden des Röhrchens sein. Absaugen des Mediums über dem Pellet.
7. Die Größe des Zellkulturkolben, die verwendet werden, um die Aggregate in zu halten sollte, hängt von der ursprünglichen Menge der Zellen. Für 6 Vertiefungen (1 Platte) von HES, behandelt ein nicht Gewebekultur T75-Flasche mit 50 ml hESC Medium sollte genutzt werden. Übertragen der Zellen aus Schritt 1.6 in den Kolben und Inkubieren bei 37 ° C.
8. Um loszuwerden der Zelltrümmer, sollte das Zellmedium und Kolben etwa 12 Stunden später ersetzt werden. Um dies zu tun, legen Sie alle mittel / Zellen in einer 50 ml Tube, drehen Sie die Zellen nach unten (200 xg für 2 min) und absaugen das alte Medium. Als Nächstes fügen Sie 50 ml frisches hESC Medium zu den Zellen, und in einen neuen T75-Flasche. Die Zellen können dann täglich gemäß demselben Verfahren (bis Tag 5) zugeführt werden.

2. Induktion von Neuroepithelzellen (D5-D17)

1. Übertragung der Zellen / Medium auf eine 50 ml-Röhrchen, und zentrifugieren die Zellen für 2 min bei 200 x g beträgt. Weiter, absaugen des Überstandes und übertragen die Zellen zu einer neuen (non-Gewebekultur behandelt) T75-Flasche mit 50 ml neuralen Induktion Medium (NIM).
2. Sobald die Zellen in NIM sind, sollte die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag ersetzt werden. Die Aggregate sollte groß genug werden, wo sie auf dem Boden eines 50 ml konischen Röhrchen auf eigene nach wenigen Minuten (keine Zentrifugation erforderlich) zu versenken. Nach 2-3 Tagen in NIM (D7-D8 insgesamt), sollten die Zellen bereit sein, auf die Platte. Laminin oder fötalem Rinderserum (FBS) verwendet werden, um zu helfen die Zellen an den Platten zu befestigen.
3. Die Anzahl von Gewebekultur behandelten Platten mit 6 Vertiefungen, die benötigt werden, hängt von der Dichte der Zellen, wie jedes Aggregat Lage sein sollten, auf der Platte für mehrere Tage wachsen ohne Berührung eines der anderen. Im Durchschnitt sind die Zellen von einemT75-Kolben erbringt ca. 4-6 6 Well-Platten im Wert von Zellen.
4. 1. Bei der Verwendung von Laminin, verdünnen Sie es in NIM auf 10-20 pg / ml zu beschichten die 6-Well-Platte (~ 0,5 ml / well). Nach der Beschichtung für 2-3 Std., Platte Zellaggregate auf 6-Well-Platten (~ 20-30 Aggregate pro Well). Nachdem die Aggregate angeschlossen haben, fügen Sie 1,5 ml der NIM.
   2. Bei der Verwendung von FBS, bereiten eine Mischung aus 90% NIM und 10% FBS (1,5 ml / well). 1,5 ml Medium mit den Zellen in jede Vertiefung, schütteln die Platte hin und her, um sich auszubreiten die Aggregate, und damit die Zellen O / N in einem Inkubator zu befestigen. Achten Sie darauf, das Medium (2 ml / Vertiefung NIM) ändern am nächsten Morgen die FBS zu entfernen.
5. Nach einem Tag oder zwei ist vernickelt, wird jedes Aggregat verteilen, um eine Monoschicht bilden. Innerhalb von ein paar Tagen werden die Zentren der meisten dieser Zellen morphologisch ähnlich aussehen Cylinderzellen (längliche). Während dieser Zeit, ändern Sie den NIM jeden zweiten Tag. Einige PSC Linien (besondersly IPSC) können säulenförmige Zellen weniger effizient zu bilden. Wenn dies geschieht, kann die Zugabe von BMP-und TGF-Inhibitoren (Dorsomorphin ^29, SB431542 ¹⁹ bei 2 uM) während Stufe 2 hilfreich sein.
6. Rund Tag 14-17, wird die säulenförmigen Zellen erscheinen kompakter. Manchmal sind diese Zellen bilden Stege oder Ringe mit sichtbarem Lumen im Inneren. Neben der säulenartigen Morphologie, exprimieren Zellen in diesem Stadium neuroepithelialen Marker wie PAX6 und SOX1 ^12,26.
7. Bevor die Isolierung beginnen kann, muss man zunächst die Zellen, um zu bestimmen, ob es irgendwelche nicht-Neuroepithelzellen vorhanden sind. Eine objektive Marker kann verwendet werden, um die nicht-neuroepithelialen Kolonien anzuzeigen. Diese können dann durch Kratzen sie mit einem Pipettenspitze beseitigt werden.

3. Generation telencephalen Vorläufer (D17-D24)

1. Die Zentren der Kolonien enthalten Neuroepithelzellen, und sollte aus dem Rest der Kolonie isoliert werden. Dies kann unter Verwendung werdeneiner Mikropipette und eine sterile 1 ml gefiltert Pipettenspitze. Wenn eine kleine Menge an Druck auf den mittleren Abschnitt der Kolonie aufgebracht wird, es in der Regel relativ leicht abhebt. Seien Sie vorsichtig, um sich nicht den äußeren Teil der Kolonie sowie lösen. Wenn die Center agieren stur und wird nicht kommen, sich auf ihre eigenen, können sie durch Herausschneiden sie mit einer Nadel unter dem Mikroskop in einem sterilen Haube entfernt werden. Übertragen Sie die mittleren Abschnitte der Kolonien zu einem 15-ml-Tube und Spin bei 200 xg für 2 min.
2. Das Medium sollte aus der Zellen abgesaugt werden. Zwei Platten Wert von Zellen können dann zu einem nicht-Gewebekultur übertragen behandelt T25-Flasche, die 10 ml NIM unter Zusatz von B27 (ohne Vitamin A, 1:50). Verwenden 5-10 ml Medium pro Platte von Zellen.
3. Wenn die Zellen angesehen werden am nächsten Tag, sollten sie über eine Sphäre Aussehen. Es ist notwendig, diese Zellen in eine neue Flasche (in Gegenwart von NIM und B27, 1:50) zu übertragen, da sie oft die peripheren Zellendie in schleichen und heften sich an der Unterseite der Flasche.
4. Die Neurosphären sollte dann in Suspension für eine Woche mit NIM mit B27 (1:50) ergänzt kultiviert werden. Um Zelle Ausdauer zu fördern und die Proliferation, cyclische AMP (cAMP, 1 pM) sowie Insulin-Wachstumsfaktor (IGF-1, 10 ng / ml) in das Medium während Suspensionskultur zugesetzt werden. An dieser Stelle enthalten die Neurospheres telencephalen Progenitoren (FOXG1 ⁺⁾ und sind bereit, auf Deckgläschen für terminale Differenzierung plattiert werden.

4. Eine weitere Differenzierung in die telencephalen Neuronen (D25 +)

1. 1. Bereiten Sie die poly-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (im 24-Well-Platten) zum Plattieren der Zellen. Deckgläser werden zuerst gereinigt und dann mit Trick-Ornithin beschichtet (mit 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, und in dem Tiefkühler).
      Poly-Ornithin Beschichtung:
      1. Sterilisieren Sie die Deckgläser: Legen Sie die Deckgläser in einerBecherglas mit Salpetersäure und sanft in die Abzugshaube schütteln für eine Stunde. Gießen Sie das Salpetersäure, spülen Sie mehrmals mit DI-Wasser, und lassen Sie die Deckgläser unter fließendem DI-Wasser für mindestens 15 min. Legen Sie die Deckgläschen in 95% Ethanol und entweder für 30 min (bei Verwendung sofort) oder speichern in Ethanol bei RT schütteln.
      2. In einer sterilen Haube, gieße den Inhalt der 50 ml Tube mit sterilisiert Deckgläser in den Deckel einer 6-Well-Platte. Mit sterilisiert Pinzette, abholen ein Deckglas zu einer Zeit und aufgerichtet in einem Well einer 24-Well-Platte. Wiederholen, so dass jeder auch ein Deckglas hat.
      3. Nachdem sie vollständig trocknen, tippen Sie auf die Platten bis Deckgläser gefallen Wohnung in jede Vertiefung. Weiter werden 100 ul Poly-Ornithin (0,1 mg / ml in sterilem dH ₂ O) zu jedem Deckglas und bebrüten die Platten O / N bei 37 ° C.
      4. Am nächsten Tag, entfernen Platten aus dem Inkubator und ihnen erlauben, auf RT abkühlen. Anzusaugen Poly-Ornithin off jedes Deckglas (von der Kante des ter Deckglas) darf dabei nicht berührt oder zerkratzt werden die Deckgläser in den Prozess. Lassen Sie die Deckgläser für ca. 30 min vor dem Waschen zu trocknen.
      5. 1 ml sterile dH ₂ O in jede Vertiefung, lassen Sie sich für 10 min, und saugen das Wasser aus jeder Vertiefung. Wiederholen Sie dies Waschschritt zwei weitere Male. Nachdem die Platten vollständig trocknen, (Urlaub deckt off in der Haube) legen Sie den Deckel auf, mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C.
   2. 1. Zur Beschichtung der Deckgläser mit Laminin, fügen Sie 50 ul einer Mischung aus neuronalen Differenzierungsmedium und Laminin (Endkonzentration von 20 ug / ml) zu jedem Poly-Ornithin behandelt Deckglas darauf achten, nur die Flüssigkeit berührt das Deckglas selbst (und nicht verschüttet Aus). Inkubieren bei 37 ° C für 1-2 Stunden vor der Herstellung der Zellen zur Befestigung.
2. Sammeln und zentrifugieren Neurosphären bei 200 xg für 2 min in einem 15-ml-Tube. Absaugen des Überstandes.
3. 1. Spülen Sie die Zellen mit DMEM-F12 und zentrifugieren Sie die Zellen wieder. Wenn die Neurospheres zu groß, um richtig zu befestigen sind, können sie dissoziiert werden mit Accutase bei diesem Schritt.
   2. Bei Verwendung Accutase: Nach Waschen der Zellen mit DMEM-F12 sind die Neurospheres dissoziiert kleine Cluster durch Zugabe Accutase (~ 2 ml) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 3 min. Anschließend fügen die gleiche Menge an Trypsininhibitor (~ 2 ml) und die Zellen zentrifugieren bei 200 × g für 3 min. Die Zellen sollten dann in NDM resuspendiert werden und gebrochen Verwendung eines P200 Pipette. Die kleinen Clustern kann dann auf vorbeschichteten Deckgläschen plattiert werden.
4. Absaugen den Großteil des Mediums und platzieren der Zellen auf einer 6 cm Petrischale in einigen Tropfen des Mediums, so daß sie auswählen wird einfacher. Fügen Sie ca. 4-5 Neurosphären jedem vorbeschichtete Deckglas. Es besteht keine Notwendigkeit, die Laminin absaugen zuerst.
5. Lassen Sie die Neurosphären für mindestens 2-4 Stunden zu befestigen. Einmal haben sie einettached gut, sollte mehr Medium (0,5 ml / Deckglas) hinzugefügt werden. Es sollte von neuralen Differenzierungsmedium mit B27 (1:50) ergänzt, cAMP (1 uM) und neurotrophen Faktoren (BDNF, GDNF, und IGF, die alle bei 10 ng / ml) bestehen. An diesem Punkt die Hälfte des Mediums kann jeden zweiten Tag gewechselt werden und diese Zellen können mehrere Monate aufrechterhalten werden.

Ergebnisse

Hier, um ein Protokoll menschlichen PSCs in telencephalen glutamatergen Neuronen differenzieren durch mehrere kritische Schritte: die Bildung von Aggregaten PSC weist die Induktion von Neuroepithelzellen, die Erzeugung von telencephalen Progenitoren und die terminale Differenzierung von Vorläuferzellen in diesen telencephalen Neuronen (Abbildung 1) beschrieben worden. Dieses System ist robust und effizient bei der Erzeugung von telencephalen Progenitoren und glutamatergen Neuronen. Als ein Beispiel

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte während der neuronalen Differenzierung. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die menschlichen pluripotenten PSCs sind, weil ansonsten die Zellen können bereits auf dem Weg zu einem nicht-neuronalen Abstammungslinie vorgespannt werden. Dies kann durch Anfärben der menschlichen PSCs mit Antikörpern gegen Pluripotenz Marker wie Oct4, Sox2, Nanog und Tra-1-60 ^1-3 bestätigt werden. Wenn die Menschen PSCs nicht sehr gut anbringen müssen nach Passagierung ihnen können ROCK-In...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Knockout Serum Replacer	Gibco	10828-028
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Non Essential Amino Acids	Gibco	1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)	Sigma	M-7522
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparin	Sigma	H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)	Sigma	116K5103
Laminin (human)	Sigma	L-6274
Laminin (mouse)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase	Invitrogen	17104-019
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
ROCK Inhibitor	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Trypsin inhibitor	Gibco	17075
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
Foxg1 antibody	Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)	Developmental Studies Hybridoma Bank	I12
Pax6 antibody (1:5000)	Developmental Studies Hybridoma Bank	PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)	Chemicon	MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)	Chemicon	AB9616
vGLUT1 antibody (1:100)	Synaptic Systems	135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R&D	1845-SH
50 ml tubes	Becton Dickinson (BD)	352098
15 ml tubes	BD	352097
6 well plates	BD	353046
24 well plates	BD	353047
T25 flasks (untreated)	BD	353009
T75 flasks (untreated)	BD	353133
Coverslips	Chemiglass Life Sciences	1760-012
6 cm Petri dishes	BD	353004
9'' glass pipetes	Fisher	13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)	Millipore	SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)	Millipore	SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)	Zeiss	R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)	Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)	The Baker Company
Centrifuge (5702 R)	Eppendorf