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요약

이 절차는 인간의 개발 기간 동안 관찰 것과 유사한 대를 이동하여 telencephalic 뉴런을 산출. 세포는 자발적으로 차별화 할 수있는 신경 계통 기수를 밀어 요인에 노출되어 격리되며, 터미널 차별화과 성숙을 할 수 있도록 coverslips에 도금되어 있습니다.

초록

여기 효율적으로 인간의 만능의 줄기 세포 (PSCs)에서 telencephalic glutamatergic 뉴런을 생성하기위한 stepwise 절차가 설명되어 있습니다. 차별화 과정은 세포가 정지 문화에 배치 할 때 응집체를 형성하도록 반올림 clumps에 인간 PSCs을 위반하여 시작됩니다. 집계 그 다음 자연 차별화 할 수 있도록하는 일 1-4에서 hESC 미디어에서 재배되어 있습니다. 이 기간 동안 세포는 세 세균 레이어의 될 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 일 5-8에서 세포는 신경 계통으로 선택을 강요 신경 유도 매체에 배치되어 있습니다. 일 8 주변 셀은 6 잘 접시에 첨부되는 시간 neuroepithelial 세포 양식을하는 동안 차별화 할 수 있습니다. 이 neuroepithelial 세포는 하루에 17 격리 할 수​​ 있습니다. 그들은 coverslips에 도금 할 준비가 될 때까지 전지 그런 다음 neurospheres로 유지 될 수 있습니다. 어떤 caudalizing 요소없이 기본적인 매체를 사용하여 neuroepithelial 전지는 specifie 아르그리고 더 효율적으로 등쪽 telencephalic progenitors과 glutamatergic 뉴런으로 차별화 할 수 있습니다 telencephalic 전구체,에 D. 전반적으로, 우리의 시스템은 이러한 뉴런의 개발과 그 영향을 미치는 질병을 연구하는 연구자에 대한 인간의 glutamatergic 뉴런을 생성 할 수있는 도구를 제공합니다.

서문

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)를 포함한 인간 만능의 줄기 세포 (PSCs)는, 뉴런 1-3을 포함하여 몸의 모든 세포 유형을 생성 할 수있는 능력을 갖추고 있습니다. 인간 PSCs의 다양한 neuronal 하위 유형의 감독 차별화 재생 의료에서​​ 이러한 세포의 응용 프로그램에 대한 키를 보유하고 있습니다. 개발하는 동안 기능 neuronal 하위 유형의 세대는 신경 계통의 유도, rostro - 꼬리 축을 따라 지역 progenitors의 사양, 그리고 4,5 지역 progenitors에서 포스트 mitotic의 신경 세포 유형의 차별화를 포함하는 복잡한 과정이다. 2001 년부터 여러 시스템은 neuronal 하위 유형 6,7의 후속 세대를위한 플랫폼을 제공 hESCs에서 신경 계통을 생성하기 위해 설립되었습니다. 발달 원리, 이러한 척추 모터 뉴런 8-12, midbrain DOP 등 여러 신경 세포 유형에 따라aminergic의 뉴런 13-15, 그리고 신경 망막 세포는 16,17 효율적으로 인간의 PSCs에서 지정된되었습니다. 이것은 생체 개발하는 동안 이러한 신경 세포 유형의 사양에 중요한 중요한 morphogens을 적용하여 이루어졌다. 다른 프로토콜도 차별화 21 홍보하기 위해 같은 작은 분자 또는 다른 세포 유형 공동 배양하여 추가 요소 18-20를 사용하여 뉴런으로 hESCs의 분화를 촉진하기 위해 개발되었습니다.

인간의 네크로은 고도로 발달과 학습, 메모리 및인지 기능 22,23에 중요한 역할을 glutamatergic 뉴런을 포함한 여러 세포 유형을 포함합니다. 문화 glutamatergic 뉴런을 생성하는 첫 번째 단계는 telencephalic 전구 세포를 지정하는 것입니다. Yoshiki Sasai의 그룹은 먼저 혈청 무료 suspensio를 사용하여 마우스 ESCs (mESCs)에서 telencephalic 전구체의 지시 차별화를보고DKK1의 존재 (Wnt 신호를 억제하는)뿐만 아니라 LeftyA (결절 신호를 억제하는) 24의 N 문화. 그 후, 우리를 포함한 여러 그룹은 혈청 무료 매체 25-27에서 인간 PSCs에서 telencephalic 전구체의 사양을보고했습니다. 인간 PSCs에서 telencephalic 전구체의 생성 외인성 morphogens 이러한 전구체를 생성의 효율성의 사용 mESCs 26,27에서보다 훨씬 높은 요구하지 않습니다. 여기 잘 장의 그룹 (7)에 의해 설립 된 신경 유도를위한 화학적으로 정의 된 시스템이 설명되어 있습니다. 외인성 caudalizing 요소의 추가없이,이 프로토콜은 효율적으로 인간의 PSCs 27 일부터 telencephalic 전구체를 생성합니다. 이 progenitors 그런 다음 Wnt와 소닉 고슴도치 (쉬이 잇)의 신호를 조절하여 등쪽이나 복부 progenitors로 구분 될 수있다. 등쪽 progenitors 더 glutamatergic 뉴런 전자로 구분할 수fficiently 27. 또한,이 프로토콜은 또한 질병의 큰 배열에 대한 작업뿐만 아니라 잠재적 인 요법의 메커니즘을 탐구하기 위해 이용 될 수있는 환자 ​​특정 뉴런의 생성을 허용 인간의 iPSCs 28 일에서 glutamatergic 뉴런의 생성을 위해 잘 작동 . 또한, 우리의 시스템은 telencephalon에서 다양한 neuronal 유형의 개발과 사양을 탐험 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

1. 인간 만능의 줄기 세포 응집체의 세대 (D1-D4)

  1. 인간 만능의 줄기 세포는 기본적인 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF, 4 NG / ML)로 보충 hESC 매체의 존재에 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 모이통에 배양되어 있습니다. 문화 5-7일 후, 식민지 큰하지만 여전히 undifferentiated 때, 그들은 다음 단계에 대한 준비가되어 있습니다.
  2. 효소 솔루션 먼저 준비해야합니다. 50 ML 튜브에 DMEM/F12 중간에 1 MG / ML 농도에서 dispase (또는 collagenase)를 분해. 예열 할 때 다음 솔루션은 최적의 혼합 때문에, 10-15 분을위한 37 ° C 물 목욕으로 매체와 효소를 포함하는 관을 배치하고 Steriflip 필터를 사용하여 소독.
  3. 세포에서 매체를 대기음, DMEM/F12과 함께 씻어,뿐만 아니라이 기능을 대기음. hESCs 기준 3 ~ 5 분 (iPSCs에 대해 최대 10 분)에 대한 보육의 각 우물과 장소에 dispase 1 ML을 추가합니다. 현미경으로 세포를 봐; 때가장자리가 약간 웅크 / 비트 어두운 모습, 셀은 다음 단계에 대한 준비가되어 있습니다. 이 3 분 후 세포를 확인하고이를 필요한 경우에 다시 넣어하는 것이 가장 좋습니다. 처음이 프로토콜을 사용하는 경우, 그것이 가능한 빨리 dispase에서 세포를 제거하는 것이 중요합니다 같은 시간에 세포의 한 판으로 시작하는 것이 가장 좋습니다.
  4. 세포에서 dispase을 대기음. 부드럽게 (세포가이 단계에서 매우 취약하며 비교적 쉽게 판에서 올 것이다) dispase을 씻어하기 위해 각도에 DMEM/F12 매체의 1.5 ML를 추가합니다. DMEM/F12를 기음과 각도에 hESC 매체의 1.5 ML를 추가합니다.
  5. 세포를 분리하고 헤어지고, (세로)의 하단 오른쪽 구석으로 10 ML 유리 피펫의 팁을 배치 잘 (셀을 터치)과 피펫을 이동 아래 - 위로 불을 지펴이 가까이에 있어야 계속 하향 스트로크합니다. 잘 반대편에 도달하면 수평 곤경에 반복ction.
  6. 세포의 모든 정지에 한 번, 15 ML 튜브에 넣어 2 분 200 XG에서 그들을 원심 분리기. 관의 맨 ​​아래에있는 세포 펠렛이 있어야합니다. 펠렛 위에서 매체를 대기음.
  7. 집계에 보관 활용해야 세포 배양 플라스크의 크기는 세포의 원래 수량에 따라 달라집니다. hESC 매체의 50 ML을 활용해야와 hESCs 6 우물 (1 판)를 들어, 하나의 비 조직 문화 T75 휴대용 술병을 취급. 37 단계 1.6에서 술병과 배양에 세포를 전송 ° C.
  8. 세포 파편을 제거하기 위해 셀 매체와 병은 약 12​​ 시간 후에 교체해야합니다. 이 작업을 수행하려면 (2 분 200 XG) 아래로 세포를 스핀, 50 ML 튜브에 매체 / 셀의 모든을 배치하고, 기존의 매체를 대기음. 다음, 새로운 T75 플라스크에 세포와 장소에 신선한 hESC 매체 50 ML를 추가합니다. 세포는 다음이 동일한 절차 (5 일까지)에 따라 매일 공급 할 수 있습니다.

2. Neuroepithelial 셀의 유도 (D5-D17)

  1. 50 ML 튜브에 세포 / 미디어를 전송, 200 X g에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기. 다음, 표면에 뜨는을 대기음, 그리고 신경 유도 매체 (님)의 50 ML과 T75 플라스크 새로운 (취급하지 않는 조직 문화)에 세포를 전송합니다.
  2. 세포 님에되면, 매체의 반이 매일 교체해야합니다. 집계는 몇 분 후에 자신의 50 ML 원뿔 튜브의 아래쪽 (더 원심 분리가 필요하지 않습니다)에 스며들게 곳을만큼 큰 수있게됩니다. 님 (D7-D8 총)에 2-3일 후, 셀 플레이트 준비가되어 있어야합니다. Laminin 또는 태아 소 혈청 (FBS)은 세포가 플레이트에 부착하기 위해 이용 될 수있다.
  3. 조직 문화의 수는 각 집계가 다른 중 하나를 밟지 않고 여러 더 많은 일 동안 접시에 성장 할 수 있어야한다로 필요한 6 잘 플레이트는 세포의 밀도에 따라 달라집니다 취급. 평균 하나의 세포T75 플라스크는 세포의 가치가 6월 4일부터 6일까지에 대한 잘 접시를 얻을 수 있습니다.
    1. laminin를 사용하는 경우, μg / ML 코트 6 잘 플레이트를 (~ 0.5 ML / 잘)에 10-20로 님에 희석. 6 - 잘 접시 (물론 당 ~ 20-30 집계)로 2-3 시간, 판 셀 집계에 코팅 한 후. 집계을 첨부 한 후 님의 1.5 ML를 추가합니다.
    2. FBS를 사용하는 경우, 90 % 님와 10 % FBS (1.5 ML / 잘)의 혼합물을 준비하고 있습니다. 각도에 셀과 매체의 1.5 ML를 추가 부드럽게 집계를 확산 앞뒤로 판을 흔들하고, 세포 배양기에서 O / N를 첨부 할 수 있습니다. FBS를 제거하려면 다음과 아침 중간 (2 ML / 잘 님의)를 변경해야합니다.
  5. 도금되는의 하루 이틀 후, 각각의 집계는 monolayer를 형성 퍼져 것입니다. 며칠 내에서 이러한 세포의 대부분의 센터는 morphologically 원주 세포 (연장)과 비슷 표시됩니다. 이 기간 동안 매일 님을 변경할 수 있습니다. 일부 PSC 라인 (특별한통증이 iPSC), 덜 효율적으로 원주 세포를 형성 할 수 있습니다. 이 경우 2 단계 동안 BMP와 TGF 억제제 (Dorsomorphin 29, 2 μM에서 SB431542 19)의 추가가 도움이 될 수 있습니다.
  6. 일 14-17 주변 주상 세포는 더 컴팩트 나타납니다. 때때로 이러한 세포 안으로 보이는 루멘과 산등성이 나 고리를 형성하고 있습니다. 주상 형태뿐만 아니라,이 단계에서 세포는 PAX6와 SOX1 12,26 등 neuroepithelial 마커를 표현한다.
  7. 절연 시작하기 전에, 하나는 먼저 현재의 비 neuroepithelial 세포가 있는지 확인하기 위해 세포를 검사해야합니다. 목표 마커는 비 neuroepithelial 식민지를 나타 내기 위해 이용 될 수있다. 이러한 다음 피펫 팁과 그것들을 스크랩하여 제거 할 수 있습니다.

3. Telencephalic Progenitors의 세대 (D17-D24)

  1. 식민지의 센터가 neuroepithelial 세포를 포함하고, 식민지의 나머지 부분으로부터 격리해야합니다. 이것은 사용하여 수행 할 수 있습니다micropipette 및 살균 한 ML 필터링 피펫 팁. 압력의 작은 금액은 식민지의 중심 부분에 적용하면 일반적으로 매우 쉽게 해제 올렸 으니까요. 식민지의 바깥 부분은 물론 분리하게하지 않도록주의하십시오. 센터는 고집이 존재하고 자신이 떨어져 오지 않을 경우에는 멸균 동네에서 현미경으로 바늘을 사용하여을 절개하여 제거 할 수 있습니다. 15 ML 튜브에 식민지의 중심 부분을 전송하고 2 분에 대해 200 XG에 스핀.
  2. 매체는 세포 오프 흡입해야합니다. (비타민 A, 1시 50분 제외) B27를 추가로 님의 10 ML을 포함 T25 휴대용 술병을 취급 세포의 가치를 두 플레이트는 다음 아닌 조직 문화로 전송 될 수 있습니다. 셀 중 하나 접시 당 매체의 5-10 ML을 사용합니다.
  3. 세포는 다음과 같은 일을 볼 때, 그들은 모양과 같은 영역이 있어야합니다. 가 자주 주변 세포이기 때문에 그것은 새로운 플라스크 (님과 B27, 1시 50분의 존재에)에 셀을 전송 할 필요가 있습니다에 몰래 술병의 바닥에 부착된다.
  4. neurospheres 그런 다음 B27 (1시 50분)를 보충 님을 사용하여 1 주일 동안 정지 배양해야합니다. 셀 지구력을 홍보하고 확산, 고리 AMP (CAMP, 1 μM)뿐만 아니라 인슐린 성장 인자 (IGF1, 10 NG / ML)하기 위해 정지 문화 중에 중간에 추가 할 수 있습니다. 이 시점에서, neurospheres이 telencephalic progenitors을 포함 (FOXG1 +) 및 단말 차별화를위한 coverslips에 도금 할 준비가 된 것입니다.

4. Telencephalic 뉴런 (D25 +)로 더 차별화

    1. 세포를 도금에 대한 poly-ornithine/laminin 코팅 coverslips을 (24도 판)를 준비합니다. Coverslips 먼저 청소하고 계략-ornithine으로 코팅 (0.1에서 MG / ML, 37 ° C, O / N, 그리고 냉장고에 저장). 아르
      폴리 - ornithine 코팅 :
      1. coverslips를 검사 :에 coverslips를 삽입비커는 질산을 포함하고 부드럽게 한 시간 동안 연기 후드에 흔들. , 질산을 쏟아 DI 물에 여러 번 헹구고, 적어도 15 분 동안 DI를 ​​흐르는 물에 coverslips 둡니다. 95 % 에탄올에 coverslips을 놓고 어느 RT 30 분 (바로 사용하는 경우) 또는 에탄올에 가게에 흔들.
      2. 멸균 후드에서 6 잘 접시의 뚜껑에 살균 coverslips를 포함하는 50 ML 튜브의 내용을 부어. 소독 집게를 사용하여 한 번에 하나의 coverslip을 선택하고 단일에 잘 24 잘 접시의 올바른 설정합니다. 각 우물이 coverslip이 너무 반복합니다.
      3. 그들은 완전히 건조 후 coverslips는 각 우물에 평면 타락 할 때까지, 접시를 누릅니다. 다음 각 coverslip에 100 μl 폴리 - ornithine을 (0.1 밀리그램 / 멸균 DH 2 O의 ML) 추가하고 번호판을 길러 37 번 O / N ° C.
      4. 다음 날, 인큐베이터에서 접시를 제거하고이를 RT로 냉각 할 수 있습니다. (t의 가장자리에서 각 coverslip의 오프 폴리 - ornithine 대기음그는 coverslip)은 과정에 coverslips을 만지거나 긁히지 않게 확실하게. coverslips는 세척하기 전에 약 30 분 동안 건조 할 수 있습니다.
      5. 잘 각각 1 ML 멸균 DH 2 O를 추가 10 분 동안 앉아 보자, 각도에서 물을 대기음. 이 페인트는 두 번 단계를 반복합니다. 접시가 완전히 건조 후, (휴가는 후드에 그냥 포함) 알루미늄 호일로 커버에 뚜껑을 배치하고, -20 ° C.에 저장
      1. laminin과 코트 coverslips을 위해, 만 coverslip 자체를 (터치 액체가주의되는 각 폴리 - ornithine 처리 coverslip에 신경 차별화 매체와 laminin (20 μg / ML의 최종 농도)의 혼합물 50 μl를 추가하고 안 불 해제). 첨부 파일의 셀을 준비하기 전에 1-2 시간에 37 ° C에서 그들을 품다.
  2. 수집하고 15 ML 튜브에 2 분에 대해 200 XG에서 neurospheres을 원심 분리기. 표면에 뜨는을 대기음.
    3. <리>
    1. DMEM-F12로 세포를 씻어 다시 세포를 원심 분리기. neurospheres이 제대로이 너무 커서 첨부 할 수있는 경우,이 단계에서 Accutase과 dissociated 수 있습니다.
    2. Accutase를 사용하는 경우는 : DMEM-F12로 세포를 세척 한 후 neurospheres는 Accutase을 (~ 2 ML)을 추가, 3 분 동안 37 ° C에서 셀을 잠복기에 의해 작은 클러스터에 dissociated 있습니다. 다음으로, 트립신 억제제 (~ 2 ML)의 동일한 금액을 추가하고 3 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포는 다음 NDM에서 다시 정지 및 P200의 피펫을 사용하여 끊어해야합니다. 작은 클러스터 그런 다음 미리 코팅 coverslips에 도금 할 수 있습니다.
  3. 매체의 대부분을 대기음하고이를 선택하면 쉽게 될 수 있도록 매체의 몇 방울에 6cm 페트리 접시 위에 셀을 배치합니다. 각 미리 코팅 coverslip에 4-5 대한 neurospheres을 추가합니다. 먼저 laminin을 기음 할 필요는 없습니다.
  4. neurospheres은 적어도 2-4 시간에 첨부 보자. 일단이잘 ttached 더 중간 (0.5 ML / coverslip)을 추가해야합니다. 그것은 신경 B27 (1시 50분)와 보충 차별화 매체, 캠프 (1 μM) 및 neurotrophic 요인 (BDNF, GDNF, 그리고 IGF, 모든 NG / ML 10시)로 구성해야합니다. 이 시점에서 매체의 절반은 매일 변경 될 수 있으며, 이러한 세포는 몇 달 동안 유지 될 수 있습니다.

결과

여기 프로토콜은 여러 중요한 단계를 telencephalic glutamatergic 뉴런에 인간 PSCs을 차별화 방법 : PSC 집계의 형성은 neuroepithelial 세포의 유도, telencephalic progenitors의 생성 및 telencephalic 뉴런에 해당 progenitors의 터미널 차별화 (그림 1)이 설명되어. 이 시스템은 telencephalic progenitors과 glutamatergic 뉴런의 생성에 강력하고 효율적이다. 예를 들어 (그림 2)으로 caudalizing 요소의 추가없이 h...

토론

신경 분화 과정에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그것은 그렇지 않으면 세포가 이미 비 neuronal 혈통이되는 방향으로 편향 될 수 있기 때문에 인간 PSCs이 만능 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 같은 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Tra-1-60 1-3로 pluripotency 마커에 대한 항체와 인간의 PSCs 얼룩으로 확인 할 수 있습니다. 인간 PSCs들을 passaging 후 잘 부착하지 않은 경우, ROCK 억제제 (Y27632)가 ?...

공개

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

감사의 말

저자는 넉넉한 FOXG1 항체를 제공하기 위해 박사 Y. Sasai 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 줄기 세포 연구 기금 (08-SCB-UCHC- 022 및 11-SCB24)과 경직 하반신 마비 재단에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Gibco11330-032
Knockout Serum ReplacerGibco10828-028
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Non Essential Amino AcidsGibco1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)SigmaM-7522
Neurobasal mediumGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
HeparinSigmaH3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)Sigma116K5103
Laminin (human)SigmaL-6274
Laminin (mouse)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
CollagenaseInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
ROCK InhibitorStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
DorsomorphinStemgent04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
Trypsin inhibitorGibco17075
0.1% gelatinMilliporeES-006-B
Foxg1 antibodyDr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)Developmental Studies Hybridoma BankI12
Pax6 antibody (1:5000)Developmental Studies Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)ChemiconMAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
vGLUT1 antibody (1:100)Synaptic Systems135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Cyclic AMP (cAMP)SigmaD-0260
Sonic hedgehog (SHH)R&D1845-SH
50 ml tubesBecton Dickinson (BD)352098
15 ml tubesBD352097
6 well platesBD353046
24 well platesBD353047
T25 flasks (untreated)BD353009
T75 flasks (untreated)BD353133
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
6 cm Petri dishesBD353004
9'' glass pipetesFisher13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)MilliporeSCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)MilliporeSCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)ZeissR2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)The Baker Company
Centrifuge (5702 R)Eppendorf

참고문헌

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