A especificação de telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células-tronco pluripotentes humanas

Resumo

Este procedimento gera os neurónios telencefálicos atravessando checkpoints que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento humano. As células são deixadas a diferenciar-se espontaneamente, são expostas a factores que os empurram no sentido da linhagem neural, são isolados, e são plaqueadas em lamelas de cobertura para permitir a diferenciação terminal e maturação.

Resumo

Aqui, um procedimento passo a passo para gerar eficientemente telencefálicos neurónios glutamatérgicos de células pluripotentes estaminais humanas (PSCs) tem sido descrita. O processo de diferenciação é iniciada quebrando as PSCs humanos em pedaços que completam-se para formar agregados quando as células são colocadas numa cultura em suspensão. Os agregados são então cultivadas em meio de hESC dias 1-4 para permitir a diferenciação espontânea. Durante este tempo, as células têm a capacidade de se transformar em qualquer uma das três camadas germinais. Dos dias 5-8, as células são colocadas num meio de indução neural para empurrá-los para a linhagem neural. Por volta do dia 8, as células são deixadas a ligar em placas de 6 poços e diferenciar tempo durante o qual a forma de células neuroepiteliais. Estas células neuroepiteliais pode ser isolado no dia 17. As células podem então ser mantidos como neuroesferas até que estejam prontas para serem semeadas em lamelas. Utilizando um meio de base sem quaisquer factores caudalizing, as células neuroepiteliais são specified em precursores telencefálicos, que podem então ser adicionalmente diferenciadas em células progenitoras dorsais e neurónios glutamatérgicos telencefálicos eficientemente. No geral, nosso sistema fornece uma ferramenta para gerar humanos neurônios glutamatérgicos aos pesquisadores para estudar o desenvolvimento desses neurônios e as doenças que os afetam.

Introdução

As células-tronco pluripotentes humanas (PSCs), incluindo tanto células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), têm a capacidade de gerar qualquer tipo de célula no corpo, incluindo neurónios ^1-3. Diferenciação dirigida de vários subtipos neuronais de PSCs humanos é a chave para a aplicação dessas células na medicina regenerativa. A geração de subtipos funcionais neuronais durante o desenvolvimento é um processo complexo, que envolve a indução da linhagem neuronal, a especificação de progenitores regionais ao longo do eixo rostro-caudal, e a diferenciação dos tipos de pós-mitóticos neuronais a partir dos progenitores regionais ^4,5. A partir de 2001, vários sistemas foram criados para gerar linhagem neural de hESCs, que forneceram uma plataforma para a geração subseqüente de subtipos neuronais ^6,7. Com base em princípios de desenvolvimento, vários tipos de neurônios, como espinhal neurônios motores ^8-12, mesencéfalo dopneurônios aminérgicos ^13-15, e as células da retina neural ^16,17 foram especificadas de forma eficiente PSCs humanos. Isto foi feito pela aplicação de morfogénios críticos que são importantes para a especificação de um destes tipos de neurónios durante o desenvolvimento in vivo. Outros protocolos também foram desenvolvidos para promover a diferenciação de neurónios em hESCs utilizando quer outros factores ^18-20, tais como as moléculas pequenas, ou por co-cultura com outros tipos de células para ajudar a promover a diferenciação ^21.

O neocórtex humano é altamente desenvolvida e contém muitos tipos de células, incluindo neurônios glutamatérgicos que desempenham um papel importante na aprendizagem, memória e função cognitiva ^22,23. O primeiro passo na geração de neurónios glutamatérgicos na cultura é especificar células progenitoras telencefálicos. Grupo Yoshiki Sasai o primeiro relataram a diferenciação de precursores dirigido telencefálicos de rato CES (mESCs) utilizando um suspensio isento de soron cultura na presença de DKK1 (que inibe a via de sinalização Wnt), bem como LeftyA (que inibe a sinalização nodal) ^24. Posteriormente, vários grupos, incluindo a nossa também relataram a especificação dos precursores telencefálicos de PSCs humanos em soro meio livre ^25-27. A geração de precursores de PSCs telencefálicos humanos não requer a utilização de morfogénios exógenas e a eficiência na geração destes precursores é muito mais elevada do que aquela a partir de mESCs ^26,27. Aqui, um sistema quimicamente definido para a indução neural que foi bem estabelecida por grupo de Zhang ⁷ foi descrita. Sem a adição de factores exógenos caudalizing, este protocolo eficiente gera precursores telencefálicos de PSCs humanos ^27. Esses progenitores pode, então, ser diferenciadas em células progenitoras dorsal ou ventral, regulando a sinalização de Wnt e sonic hedgehog (SHH). Dorsal Os progenitores podem ainda se diferenciar em neurônios e glutamatérgicafficiently ^27. Além disso, este protocolo também funciona bem para a geração de neurónios glutamatérgicos do iPSCs humano ^28, que permite a geração de neurónios específicos do paciente, que podem ser utilizados para explorar o mecanismo de acção, assim como terapias potenciais para uma grande variedade de doenças . Além disso, o nosso sistema também fornece uma plataforma para explorar o desenvolvimento e especificação de diversos tipos neuronais no telencéfalo.

Protocolo

1. Geração de pluripotentes humanas Agregados de Células Tronco (D1-D4)

1. As células estaminais pluripotentes humanas são cultivadas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEF) alimentadores na presença de meio de hESC suplementado com factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Após 5-7 dias de cultura, quando as colónias são grandes, mas ainda não-diferenciada, eles estão prontos para o próximo passo.
2. A solução de enzima deve primeiro ser preparado. Num tubo de 50 ml, dissolve-se a dispase (ou colagenase) a uma concentração de 1 mg / ml em meio DMEM/F12. Uma vez que estas soluções misture melhor quando aquecido, colocar o tubo contendo o meio e da enzima em banho-maria a 37 ° C durante 10-15 min e em seguida esterilizar utilizando um filtro Steriflip.
3. Aspirar o meio a partir das células, lavá-los com DMEM/F12, e aspirar esta fora também. Adicionar 1 ml de dispase a cada poço e colocar no incubador durante 3-5 min para hESCs (até 10 minutos para iPSCs). Olhe para as células ao microscópio, quandoas bordas enrolar ligeiramente / olhar um pouco mais escura, as células estão prontas para a próxima etapa. É melhor para verificar as células após 3 min e colocá-los de volta se necessário. Quando se utiliza este protocolo, pela primeira vez, é melhor começar com apenas uma placa de células de cada vez, uma vez que é importante para remover as células da dispase tão rapidamente quanto possível.
4. Aspirar a dispase a partir das células. Suavemente (as células são muito vulnerável nesta fase e vai sair da placa de forma relativamente fácil) adicionar 1,5 ml de meio DMEM/F12 a cada poço, a fim de enxaguar o dispase. Aspirar o DMEM/F12 e adicionar 1,5 ml de meio de hESC a cada poço.
5. Para separar e romper as células, coloque a ponta de uma pipeta de vidro de 10 ml para o canto inferior direito de um poço (tocar as células) e mover a pipeta para cima e para baixo (verticalmente) - o stoke ascendente deve estar em estreita proximidade para o acidente vascular cerebral processo descendente. Uma vez que o outro lado do poço é alcançado, repetir na dire horizontalction.
6. Uma vez que todas as células estão em suspensão, colocá-los em tubos de 15 ml e centrifugar a 200 xg-los, durante 2 minutos. Deve haver um pellet de células no fundo do tubo. Aspirar o meio a partir de acima do pellet.
7. O tamanho do frasco de cultura de célula que deve ser utilizada para manter os agregados depende da quantidade inicial de células. Para 6 poços (1 placa) de hESCs, uma cultura de tecido não-tratada balão T75 com 50 ml de meio de hESC deve ser utilizado. Transferir as células do passo 1.6 para o frasco e incubar a 37 ° C.
8. A fim de se livrar dos detritos de células, o meio celular e frasco deve ser substituído a cerca de 12 horas mais tarde. Para fazer isso, colocar a totalidade do meio / células para um tubo de 50 ml, as células girar para baixo (200 xg durante 2 min), e aspirar o meio velho. Em seguida, adicionar 50 ml de meio fresco hESC para as células, e colocar em um frasco T75 novo. As células podem então ser alimentadas diariamente seguindo este mesmo procedimento (até o dia 5).

2. A indução de células neuroepiteliais (D5-D17)

1. Transferir as células / médio para um tubo de 50 ml e centrifugar as células durante 2 minutos a 200 x g. Em seguida, aspirar fora o sobrenadante, e transferir as células para um novo (cultura de tecidos não-tratado) T75 frasco com 50 ml de meio de indução neural (NIM).
2. Uma vez que as células estão em NIM, metade do meio deve ser substituído a cada dois dias. Os agregados devem ser suficientemente grandes para onde irão afundar-se no fundo de um tubo cónico de 50 ml, por si só depois de alguns minutos (sem centrifugação necessário). Depois de 2-3 dias de NIM (D7-D8 total), as células devem estar prontos a placa. Laminina ou soro fetal bovino (FBS) pode ser utilizado para ajudar a fixar as células às placas.
3. O número de cultura de tecidos tratados placas de 6 cavidades que são necessários depende da densidade das células à medida que cada agregado deve ser capaz de crescer sobre a placa por mais alguns dias, sem tocar em qualquer um dos outros. Em média, as células de umT75 frasco vai render cerca de 4-6 placas de 6 poços no valor de células.
4. 1. Se utilizar a laminina, diluir em NIM a 10-20 ug / ml para o revestimento da placa de 6 poços (~ 0,5 ml / poço). Após o revestimento por 2-3 hr, os agregados de células em placas de 6 poços (~ 20-30 agregados por poço). Depois, os agregados ter anexado, adicionar 1,5 ml de NIM.
   2. Se usar FBS, preparar uma mistura de NIM e 90% de FBS a 10% (1,5 ml / poço). Adicionar 1,5 ml de meio com as células para cada poço, agitar suavemente a placa para trás e para frente para espalhar os agregados, e permitir que as células de anexar S / N na incubadora. Certifique-se de mudar o meio (2 ml / poço de NIM) na manhã seguinte para remover o FBS.
5. Após um dia ou dois de ser banhado, cada agregado vai espalhar-se para formar uma monocamada. Dentro de alguns dias, os centros da maioria destas células se morfologicamente parecem semelhantes às células colunares (alongado). Durante este período, mudar o NIM todos os dias. Algumas linhas PSC (especially iPSC), pode formar células colunares menos eficientemente. Se isso acontecer, a adição de BMP e TGF (inibidores Dorsomorphin ^29, SB431542 ¹⁹ a 2 ^ M) durante a fase 2 pode ser útil.
6. Cerca de 14-17 dias, as células colunares aparecerá mais compacto. Às vezes, essas células formam cordões ou anéis com lúmen visíveis dentro. Além da morfologia colunar, as células nesta fase expressam marcadores gliais, tais como PAX6 e SOX1 ^12,26.
7. Antes do isolamento pode começar, é preciso primeiro examinar as células para determinar se existem quaisquer células não neuroepiteliais presentes. Um marcador de objectivo pode ser utilizada para indicar as colónias não-neuroepiteliais. Estes podem então ser eliminados por raspagem com eles com uma ponta de pipeta.

3. Geração de Progenitores telencefálica (D17-D24)

1. Os centros das colónias contêm as células neuroepiteliais, e deve ser isolado do resto da colónia. Isto pode ser feito usandouma micropipeta e uma solução estéril de 1 ml da ponteira filtrada. Quando uma pequena quantidade de pressão é aplicada na porção central da colónia, que, geralmente, desprende-se facilmente. Seja cauteloso para não deixar a parte exterior da colônia destacar também. Se os centros estão sendo teimosa e não sair por si próprios, podem ser removidos por excisão-las utilizando uma agulha com um microscópio numa câmara estéril. Transferir as porções centrais das colónias para um tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 2 min.
2. O meio deve ser aspirados para fora das células. Duas placas no valor de células podem então ser transferidas para uma cultura de tecido não-tratado T25 frasco contendo 10 ml de NIM com a adição de B27 (sem vitamina A, 1:50). Use 5-10 ml de meio por uma placa de células.
3. Quando as células são visualizadas no dia seguinte, eles devem ter uma esfera como a aparência. É necessário transferir essas células para um balão de novo (na presença de NIM e B27, 1:50), uma vez que é muitas vezes as células periféricasque sneak dentro e anexar ao fundo do frasco.
4. O neuroesferas deve então ser cultivadas em suspensão durante uma semana utilizando NIM suplementado com B27 (1:50). A fim de promover a resistência e proliferação celular, AMP cíclico (cAMP, 1 uM), bem como o factor de crescimento semelhante à insulina (IGF1, 10 ng / ml) pode ser adicionado para o meio durante a cultura em suspensão. Neste ponto, as neuroesferas contêm progenitores telencefálicos FOXG1 ⁽⁺⁾ e está pronta para ser plaqueada em lamelas para a diferenciação terminal.

4. Maior diferenciação nos neurônios telencefálicos (D25 +)

1. 1. Preparar as lamelas poly-ornithine/laminin revestidos (em placas de 24 poços) para plaqueamento das células. As lamelas são em primeiro lugar limpas, e são depois revestidas com manobra ornitina-(a 0,1 mg / ml, 37 ° C, S / N, e armazenado no congelador).
      Poli-ornitina revestimento:
      1. Esterilizar as lamelas: Coloque as lamelas em umbéquer contendo ácido nítrico e agitar suavemente na hotte durante uma hora. Deitar fora o ácido nítrico, lavar várias vezes com água desionizada, e deixar as lamelas com água corrente DI durante pelo menos 15 min. Coloque as lamelas em 95% de etanol e agita-se durante ou 30 min (se utilizar de imediato) ou armazenamento em etanol à temperatura ambiente.
      2. Em um capuz estéril, derramar o conteúdo do tubo de 50 ml contendo lamelas esterilizadas para a tampa de uma placa de 6 poços. Usando uma pinça esterilizada, pegar uma lamela de cada vez e colocado verticalmente, num único poço de uma placa de 24 poços. Repetir, de modo que cada poço tem uma lamela.
      3. Depois que secar completamente, toque as placas até lamínulas caíram apartamento em cada poço. Em seguida adicionar 100 ul de poli-ornitina (0,1 mg / ml em _dH2O estéril) de cada lamela e incuba-se as placas de O / N a 37 ° C.
      4. No dia seguinte, remover placas da incubadora e permitir-se arrefecer para a TA. Aspirar poli-ornitina a partir de cada lamela (a partir da borda tele lamela) tomando cuidado para não tocar ou coçar as lamelas no processo. Permitir que as lamelas secar durante cerca de 30 min antes da lavagem.
      5. Adicionar 1 ml _de dH2O estéril a cada poço, deixar sentar durante 10 min, e aspirar a água de cada poço. Repita esta lavagem passo mais duas vezes. Após as placas de secar completamente, (licença de tampas na capa) colocar as tampas, cubra com papel alumínio e armazenar a -20 ° C.
   2. 1. Para revestir as lamelas com laminina, adicionar 50 ul de uma mistura de meio de diferenciação neuronal e laminina (concentração final de 20 ug / ml) a cada lamela poli-ornitina tratados com o cuidado de ter apenas o líquido toque a lamela em si (e não derramar off). Incubar a 37 ° C durante 1-2 horas antes de preparar as células para a fixação.
2. Recolher e centrifugar a neuroesferas a 200 xg durante 2 min num tubo de 15 ml. Aspirar o sobrenadante.
3. 1. Lavar as células com DMEM-F12 e centrifugar as células novamente. Se as neuroesferas são demasiado grandes para prender adequadamente, eles podem ser dissociadas com Accutase nesta etapa.
   2. Se utilizando Accutase: Após lavagem das células com DMEM-F12, as neuroesferas são dissociados para conjuntos pequenos adicionando Accutase (~ 2 ml) e incubando as células a 37 ° C durante 3 min. Em seguida, adicionar a mesma quantidade de inibidor de tripsina (~ 2 ml) e centrifugar as células a 200 xg durante 3 min. As células devem então ser re-suspenso em NDM e quebrada com uma pipeta de P200. Os pequenos agregados podem então ser plaqueadas em lamelas de cobertura pré-revestidos.
4. Aspirar fora a maioria do meio e colocar as células em uma placa de Petri de 6 cm de algumas gotas do meio, de modo que se torna mais fácil selecionando-as. Adicionar cerca de 4-5 neuroesferas a cada lamela pré-revestido. Não há necessidade de aspirar para fora da laminina em primeiro lugar.
5. Deixe as neuroesferas anexar durante pelo menos 2-4 horas. Uma vez que têm umttached bem, mais meio (0,5 ml / lamínula) deve ser adicionado. Deve consistir de meio de diferenciação neural suplementado com B27 (1:50), cAMP (1 uM), e os factores neurotróficos (BDNF, GDNF e IGF, todos a 10 ng / ml). Neste ponto a metade do meio pode ser mudado a cada dois dias e estas células podem ser mantidas durante vários meses.

Resultados

Aqui, um protocolo para diferenciar PSCs humanos em telencefálicos neurónios glutamatérgicos através de diversos passos críticos: a formação de agregados de PSC, a indução de células neuroepiteliais, a geração de células progenitoras telencefálicos, e a diferenciação terminal de células progenitoras em neurónios estes telencefálicos (Figura 1) possui foram descritos. Este sistema é robusto e eficiente na geração de células progenitoras telencefálicos e neurónios glutamatérgicos...

Discussão

Existem vários passos cruciais durante o processo de diferenciação neuronal. É importante assegurar que as PSCs são pluripotentes humanas porque de outro modo as células podem já ser inclinado para tornar-se uma linhagem não-neuronal. Isto pode ser confirmado por coloração das PSCs humanos com anticorpos contra marcadores de pluripotência como Oct4, Sox2, Nanog e Tra-1-60 ^1-3. Se as PSCs humanos não dão muito bem após passaging deles, ROCK inibidor (Y27632) pode ser adicionado para ajudar. Para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Knockout Serum Replacer	Gibco	10828-028
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Non Essential Amino Acids	Gibco	1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)	Sigma	M-7522
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparin	Sigma	H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)	Sigma	116K5103
Laminin (human)	Sigma	L-6274
Laminin (mouse)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase	Invitrogen	17104-019
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
ROCK Inhibitor	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Trypsin inhibitor	Gibco	17075
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
Foxg1 antibody	Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)	Developmental Studies Hybridoma Bank	I12
Pax6 antibody (1:5000)	Developmental Studies Hybridoma Bank	PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)	Chemicon	MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)	Chemicon	AB9616
vGLUT1 antibody (1:100)	Synaptic Systems	135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R&D	1845-SH
50 ml tubes	Becton Dickinson (BD)	352098
15 ml tubes	BD	352097
6 well plates	BD	353046
24 well plates	BD	353047
T25 flasks (untreated)	BD	353009
T75 flasks (untreated)	BD	353133
Coverslips	Chemiglass Life Sciences	1760-012
6 cm Petri dishes	BD	353004
9'' glass pipetes	Fisher	13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)	Millipore	SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)	Millipore	SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)	Zeiss	R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)	Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)	The Baker Company
Centrifuge (5702 R)	Eppendorf