La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Riepilogo

Questa procedura produce neuroni telencefalici passando attraverso i punti di controllo che sono simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Le cellule possono differenziarsi spontaneamente, sono esposti a fattori che li spingono verso il lineage neurale, sono isolati, e vengono piastrate su vetrini per consentire la differenziazione terminale e maturazione.

Abstract

Qui, una procedura graduale per generare efficacemente telencefalici neuroni glutamatergici da cellule staminali pluripotenti (PSC) è stato descritto. Il processo di differenziazione è iniziato rompendo i PSC umani in ciuffi che completano fino a formare aggregati quando le cellule sono posti in coltura in sospensione. Gli aggregati vengono poi coltivate in terreno hESC da 1-4 giorni per consentire differenziazione spontanea. Durante questo periodo, le cellule hanno la capacità di diventare uno dei tre strati germinali. Da 5-8 giorni, le cellule sono posti in un mezzo di induzione neurale per spingerli nella discendenza neurale. Circa 8 giorni, le cellule vengono fatte attaccare su piastre da 6 pozzetti e differenziare durante i quali la forma neuroepiteliale cellule. Queste cellule possono essere isolate neuroepiteliale al giorno 17. Le cellule possono quindi essere mantenuta come neurosfere finché non sono pronti per essere piastrate su vetrini. Utilizzo di un supporto di base senza alcun fattore caudalizing, cellule neuroepiteliali sono spécifiéd in precursori telencefalici, che possono poi essere ulteriormente differenziate in progenitori telencefalici dorsali e neuroni glutamatergici in modo efficiente. Nel complesso, il nostro sistema fornisce uno strumento per generare neuroni umani glutamatergici per i ricercatori per studiare lo sviluppo di questi neuroni e le malattie che li riguardano.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti (PSC), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), hanno la capacità di generare ogni tipo di cellula del corpo, compresi i neuroni ^1-3. Differenziazione diretta dei vari sottotipi neuronali da CSP umani è la chiave per l'applicazione di queste cellule nella medicina rigenerativa. La generazione di funzionali sottotipi neuronali durante lo sviluppo è un processo complesso che coinvolge l'induzione di lignaggio neurale, la specificazione dei progenitori regionali lungo l'asse rostro-caudale, e la differenziazione di post-mitotici tipi di neuroni dai progenitori regionali ^4,5. A partire dal 2001, i sistemi sono stati creati vari per generare discendenza da hESC neurale, che hanno fornito una piattaforma per la generazione successiva di sottotipi neuronali ^6,7. Basato su principi di sviluppo, i tipi di neuroni diversi, come spinale motoneuroni ^8-12, mesencefalo dopneuroni aminergici ^13-15, e le cellule neurali della retina ^16,17 sono stati efficacemente specificato da CSP umani. Ciò è stato fatto applicando morfogeni critici che sono importanti per la specifica di questi tipi di neuroni durante lo sviluppo in vivo. Altri protocolli sono stati sviluppati anche per promuovere la differenziazione delle hESC in neuroni utilizzando sia fattori addizionali ^18-20 come piccole molecole o mediante co-coltura con altri tipi cellulari per promuovere la differenziazione ^21.

La neocorteccia umana è altamente sviluppato e contiene molti tipi di cellule, tra cui i neuroni glutamatergici che svolgono un ruolo importante per l'apprendimento, la memoria e le funzioni cognitive ^22,23. Il primo passo nel generare neuroni glutamatergici in coltura è specificare cellule progenitrici telencefalici. Gruppo Yoshiki Sasai primo riportato la differenziazione dei precursori telencefalici diretto da mouse CES (mESCs) con un siero privo suspension coltura in presenza di DKK1 (che inibisce segnalazione Wnt) nonché LeftyA (che inibisce nodale segnalazione) ^24. In seguito, diversi gruppi tra cui i nostri hanno anche riportato la specificazione dei precursori telencefalici dal PSC umani nel siero terreno privo di ^25-27. La generazione di precursori telencefalici da CSP umani non richiede l'uso di morfogeni esogeni e l'efficienza nella generazione di questi precursori è molto superiore a quella da mESCs ^26,27. Qui, un sistema chimicamente definito per induzione neurale che è stato ben stabilito dal gruppo di Zhang ⁷ è stato descritto. Senza l'aggiunta di fattori esogeni caudalizing, questo protocollo genera in modo efficiente precursori telencefalici dal PSC umani ^27. Questi progenitori possono essere differenziate in progenitori dorsale o ventrale regolando la segnalazione di Wnt e sonic hedgehog (SHH). I progenitori dorsali possono ulteriormente differenziarsi in neuroni e glutamatergicafficiently ^27. Inoltre, questo protocollo funziona bene anche per la generazione di neuroni glutamatergici da umano iPSCs ^28, che consente la generazione di paziente-specifici neuroni che possono essere utilizzati per esplorare il meccanismo di azione e terapie potenziali per una vasta gamma di malattie . Inoltre, il nostro sistema fornisce anche una piattaforma per esplorare lo sviluppo e le specifiche dei diversi tipi di neuroni nel telencefalo.

Protocollo

1. Generazione di aggregati umani di cellule staminali pluripotenti (D1-D4)

1. Le cellule staminali pluripotenti sono coltivati ​​in fibroblasti embrionali di topo (MEF) alimentatori in presenza di terreno hESC supplementato con fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Dopo 5-7 giorni di cultura, quando le colonie sono grandi, ma ancora indifferenziati, sono pronti per il passo successivo.
2. La soluzione enzimatica deve prima essere preparato. In una provetta da 50 ml, sciogliere il dispasi (o collagenasi) a mg / ml di concentrazione in 1 DMEM/F12 medie. Dal momento che queste soluzioni mescolare meglio quando riscaldato, porre la provetta contenente il mezzo e l'enzima in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10-15 minuti e poi sterilizzare utilizzando un filtro Steriflip.
3. Aspirare il mezzo fuori dalle cellule, sciacquare con DMEM/F12, e aspirare il fuori pure. Aggiungere 1 ml di dispasi in ogni pozzetto e posto in incubatrice per 3-5 min per hESC (fino a 10 min per iPSCs). Guarda le cellule al microscopio, quandoarricciare i bordi leggermente / guardare un po 'più scuro, le cellule sono pronti per il passo successivo. Si consiglia di controllare le celle dopo 3 minuti e riporli in caso di necessità. Quando si utilizza questo protocollo per la prima volta, è meglio cominciare con solo una piastra di cellule in un momento in quanto è importante rimuovere le cellule dal dispasi più rapidamente possibile.
4. Aspirare il dispasi fuori dalle cellule. Delicatamente (le cellule sono molto vulnerabili in questa fase e verrà via della piastra con relativa facilità) aggiungere 1,5 ml di DMEM/F12 media in ciascun pozzetto in modo da risciacquare il dispasi. Aspirare fuori DMEM/F12 e aggiungere 1,5 ml di mezzo di hESC in ciascun pozzetto.
5. Per staccare e rompere le cellule, posizionare la punta di una pipetta 10 ml in vetro verso l'angolo in basso a destra di un pozzo (toccando le cellule) e spostare la pipetta su e giù (in verticale) - verso l'alto stoke dovrebbe essere nelle immediate vicinanze la corsa verso il basso procedimento. Una volta che il lato del bene è arrivato, ripetere la disastrosa orizzontalection.
6. Una volta che tutte le cellule sono in sospensione, metterli in provette da 15 ml e centrifugare loro a 200 xg per 2 min. Ci dovrebbe essere un pellet di cellule al fondo della provetta. Aspirare il mezzo fuori da sopra il pellet.
7. La dimensione del pallone di coltura cellulare che dovrebbe essere utilizzato per mantenere gli aggregati dipende dalla quantità originale di cellule. Da 6 pozzetti (1 piastra) di hESC, uno non-tessuto coltura trattata T75 pallone con 50 ml di mezzo hESC devono essere utilizzati. Trasferire le cellule dal passo 1,6 al pallone e incubare a 37 ° C.
8. Al fine di eliminare i detriti cellulari, il mezzo cella e pallone deve essere sostituito dopo circa 12 ore. Per fare questo, inserire tutti i medio / cellule in una provetta da 50 ml, far girare le celle in basso (200 xg per 2 minuti), e aspirare fuori il mezzo vecchio. Successivamente, aggiungere 50 ml di terreno fresco hESC alle cellule, e posto in un nuovo T75 pallone. Le cellule possono quindi essere alimentati quotidianamente seguendo la stessa procedura (fino al giorno 5).

2. L'induzione di cellule neuroepiteliali (D5-D17)

1. Trasferire le cellule / mezzo di un tubo da 50 ml, e centrifugare le cellule per 2 minuti a 200 x g. Successivo, aspirare il surnatante, e trasferire le cellule ad una nuova (non-tessuto coltura trattata) T75 pallone con 50 ml di mezzo di induzione neurale (NIM).
2. Una volta che le cellule sono in NIM, mezzo del mezzo deve essere sostituito ogni altro giorno. Gli aggregati dovrebbero diventare grande abbastanza per cui si depositano sul fondo di un tubo da 50 ml in proprio dopo pochi minuti (senza centrifugazione richiesto). Dopo 2-3 giorni di NIM (D7-D8 totale), le cellule devono essere pronti a piastra. Laminina o siero bovino fetale (FBS) può essere utilizzata per aiutare le cellule attaccano alle piastre.
3. Il numero di coltura di tessuti trattati piastre da 6 pozzetti necessari dipende dalla densità delle cellule come ogni aggregato deve essere in grado di crescere sul piatto per parecchi giorni senza toccare nessuna delle altre. In media, le celle da unaT75 pallone produrrà circa 4-6 6 piatti e vale la pena di cellule.
4. 1. Se si utilizza laminina, diluirlo NIM al 10-20 ug / ml per rivestire la piastra da 6 pozzetti (~ 0,5 ml / pozzetto). Dopo il rivestimento per 2-3 ore, aggregati piastra cellulare in piastre da 6 pozzetti (~ 20-30 aggregati per pozzetto). Dopo gli aggregati hanno attaccato, aggiungere 1,5 ml di NIM.
   2. Se si utilizza FBS, preparare una miscela di 90% NIM e 10% FBS (1,5 ml / pozzetto). Aggiungere 1,5 ml di terreno con le cellule di ogni pozzetto, scuotere delicatamente il piatto avanti e indietro per diffondere gli aggregati, e permettere alle cellule di attaccarsi O / N in un incubatore. Assicurarsi di cambiare il mezzo (2 ml / pozzetto di NIM) la mattina seguente per rimuovere la FBS.
5. Dopo un giorno o due di essere placcato, ogni aggregato si allargano a formare un monostrato. Nel giro di un paio di giorni, i centri della maggior parte di queste cellule morfologicamente sembrano simili alle cellule colonnari (allungata). Durante questo periodo, modificare il NIM ogni altro giorno. Alcune linee di PSC (especially IPSC), possono formare cellule colonnari meno efficiente. In questo caso, l'aggiunta di inibitori BMP e TGF (Dorsomorphin ²⁹ SB431542 ¹⁹ a 2 pm) durante la fase 2 può essere utile.
6. Intorno al giorno 14-17, le cellule colonnari apparirà più compatta. A volte queste cellule formano creste o anelli a lume visibili all'interno. Oltre alla morfologia colonnare, le cellule in questa fase esprimere marcatori neuroepiteliale, come PAX6 e SOX1 ^12,26.
7. Prima di iniziare l'isolamento, si deve prima esaminare le cellule per determinare se ci sono cellule presenti non neuroepiteliale. Un marcatore obiettivo può essere utilizzata per indicare i non-neuroepiteliale colonie. Questi possono poi essere eliminati raschiando via con una pipetta.

3. Generazione di Progenitori telencefalici (D17-D24)

1. I centri delle colonie contengono le cellule neuroepiteliali, e deve essere isolata dal resto della colonia. Questo può essere fatto utilizzandouna micropipetta e un puntale sterile da 1 ml di filtrato. Quando una piccola quantità di pressione è applicata alla parte centrale della colonia, solleva generalmente fuori abbastanza facilmente. Essere prudenti per non lasciare la porzione esterna della colonia staccare pure. Se i centri sono testardo e non verranno per conto loro, essi possono essere rimossi ablazione utilizzando un ago al microscopio in una cappa sterile. Trasferire le porzioni centrali delle colonie in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 2 min.
2. Il terreno deve essere aspirato fuori delle cellule. Due piastre di valore di cellule può poi essere trasferito in un non-tessuto coltura trattata T25 pallone contenente 10 ml di NIM con l'aggiunta di B27 (senza vitamina A, 1:50). Utilizzare 5-10 ml di terreno per una piastra di cellule.
3. Quando le cellule sono visti il ​​giorno seguente, essi dovrebbero avere una sfera come l'apparenza. È necessario trasferire queste cellule in un matraccio nuova (in presenza di NIM e B27, 1:50) come è spesso cellule perifericheche furtivamente e allegare al fondo del pallone.
4. Il neurosfere dovrebbe quindi essere coltivati ​​in sospensione per una settimana con NIM integrato con B27 (1:50). Al fine di promuovere la resistenza e la proliferazione cellulare, AMP ciclico (cAMP, 1 pM) e fattore di crescita insulina (IGF1, 10 ng / ml) può essere aggiunto nel terreno di coltura durante la sospensione. A questo punto, le neurosfere contengono progenitori telencefalici Foxg1 ⁽⁺⁾ e sono pronti per essere piastrate su vetrini per differenziazione terminale.

4. Un'ulteriore differenziazione nei neuroni telencefalici (D25 +)

1. 1. Preparare i coprioggetti poly-ornithine/laminin rivestite (in piastre da 24 pozzetti) per la placcatura cellule. Coprioggetti vengono prima puliti, e viene rivestito da manovra-ornitina (a 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, e conservate nel congelatore).
      Poly-ornitina rivestimento:
      1. Sterilizzare i coprioggetti: Posizionare i vetrini in unbecher contenente acido nitrico e scuotere delicatamente sotto cappa per un'ora. Versare l'acido nitrico, risciacquare più volte con acqua deionizzata, e lasciare i coprioggetti sotto l'acqua deionizzata per almeno 15 minuti. Posizionare i vetrini in etanolo al 95% e sia agitare per 30 minuti (se si utilizza subito) o conservare in etanolo a temperatura ambiente.
      2. In una cappa sterile, versare il contenuto della provetta da 50 ml contenente coprioggetti sterilizzati nel coperchio di una piastra da 6 pozzetti. Utilizzando pinze sterili, prendere uno vetrino alla volta e in posizione verticale in un unico pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Ripetere in modo che ogni bene ha un coprioggetto.
      3. Dopo aver asciugare completamente, toccare le piastre fino coprioggetti sono caduti appartamento in ciascun pozzetto. Aggiungere quindi 100 pl poli-ornitina (0,1 mg / ml in sterile dH ₂ O) a ciascun vetrino coprioggetto e incubare le piastre O / N a 37 ° C.
      4. Il giorno dopo, rimuovere le piastre dal termostato e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Aspirare poly-ornitina off di ciascun coprioggetto (dal bordo di tlui coprioggetto) facendo attenzione a non toccare o graffiare i coprioggetti nel processo. Lasciare i coprioggetti asciugare per circa 30 minuti prima del lavaggio.
      5. Aggiungere 1 ml sterile dH ₂ O a ciascun pozzetto, lasciate riposare per 10 min, e aspirare l'acqua da ogni pozzetto. Ripetere questa fase di lavaggio altre due volte. Dopo le piastre asciugare completamente, (congedo copre fuori nella cappa) posizionare i coperchi su, coprire con un foglio di alluminio, e conservare a -20 ° C.
   2. 1. Per rivestire i coprioggetti con laminina, aggiungere 50 microlitri di una miscela di terreno di differenziamento neurale e laminina (concentrazione finale di 20 pg / ml) ad ogni poli-ornitina coprioggetto trattati facendo attenzione ad avere solo il liquido tocca la stessa coprioggetto (e non spargimento off). Incubare a 37 ° C per 1-2 ore prima di preparare le cellule per il fissaggio.
2. Raccogliere e centrifugare neurosfere a 200 xg per 2 minuti in una provetta da 15 ml. Aspirare il sopranatante.
3. 1. Lavare le cellule con DMEM-F12 e centrifugare le cellule di nuovo. Se le neurosfere sono troppo grandi per collegare correttamente, possono essere dissociati con Accutase in questa fase.
   2. Se si utilizza Accutase: Dopo aver lavato le cellule con DMEM-F12, le neurosfere sono dissociati per piccoli cluster aggiungendo Accutase (~ 2 ml) e incubando le cellule a 37 ° C per 3 min. Successivamente, aggiungere la stessa quantità di inibitore della tripsina (~ 2 ml) e centrifugare le cellule a 200 xg per 3 min. Le cellule devono quindi essere risospeso in NDM e rotto utilizzando una pipetta P200. I cluster di piccole dimensioni possono essere piastrate su vetrini pre-verniciati.
4. Aspirare off la maggioranza del mezzo e posizionare le cellule su un piatto Petri 6 centimetri in poche gocce del mezzo in modo che selezionandoli diventa più facile. Aggiungi circa 4-5 neurosfere di ogni pre-rivestito coprioggetto. Non vi è alcuna necessità di aspirare largo della laminina prima.
5. Lasciate che il neurosfere attaccare per almeno 2-4 ore. Una volta che hanno unttached bene, più a medio (0,5 ml / vetrino) dovrebbe essere aggiunto. Si dovrebbe consistere di terreno di differenziamento neurale supplementato con B27 (01:50), cAMP (1 pM), e fattori neurotrofici (BDNF, GDNF, e IGF, il tutto a 10 ng / ml). A questo punto mezzo del mezzo può essere cambiato ogni altro giorno e queste cellule possono essere mantenute per diversi mesi.

Risultati

Qui, un protocollo per differenziare PSCs umani in telencefalici neuroni glutamatergici attraverso diverse fasi fondamentali: la formazione di aggregati PSC, l'induzione di cellule neuroepiteliali, la generazione di progenitori telencefalici, e la differenziazione terminale di questi progenitori in neuroni telencefalici (Figura 1) ha stato descritto. Questo sistema è robusto ed efficiente nella generazione dei progenitori telencefalici e neuroni glutamatergici. Come esempio (Figura 2),

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici durante il processo di differenziazione neurale. È importante garantire che i PSC umani sono pluripotenti perché altrimenti le cellule possono già essere polarizzato verso diventare un non-lineage neuronale. Ciò può essere confermato dalla colorazione dei PSC umani con anticorpi contro marcatori pluripotenza come Oct4, Sox2, Nanog, e Tra-1-60 ^1-3. Se i PSC umani non attribuiscono molto bene dopo passaging di loro, inibitore ROCK (Y27632) può essere aggiunto per aiutare. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Knockout Serum Replacer	Gibco	10828-028
L-glutamine (200 mM)	Gibco	25030
Non Essential Amino Acids	Gibco	1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)	Sigma	M-7522
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparin	Sigma	H3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)	Sigma	116K5103
Laminin (human)	Sigma	L-6274
Laminin (mouse)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A-7906
Dispase	Gibco	17105-041
Collagenase	Invitrogen	17104-019
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
ROCK Inhibitor	Stemgent	04-0012
SB431542	Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Trypsin inhibitor	Gibco	17075
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
Foxg1 antibody	Dr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)	Developmental Studies Hybridoma Bank	I12
Pax6 antibody (1:5000)	Developmental Studies Hybridoma Bank	PAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)	Chemicon	MAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)	Chemicon	AB9616
vGLUT1 antibody (1:100)	Synaptic Systems	135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
Cyclic AMP (cAMP)	Sigma	D-0260
Sonic hedgehog (SHH)	R&D	1845-SH
50 ml tubes	Becton Dickinson (BD)	352098
15 ml tubes	BD	352097
6 well plates	BD	353046
24 well plates	BD	353047
T25 flasks (untreated)	BD	353009
T75 flasks (untreated)	BD	353133
Coverslips	Chemiglass Life Sciences	1760-012
6 cm Petri dishes	BD	353004
9'' glass pipetes	Fisher	13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)	Millipore	SCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)	Millipore	SCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)	Zeiss	R2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)	Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)	The Baker Company
Centrifuge (5702 R)	Eppendorf