Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien

Zusammenfassung

Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.

Zusammenfassung

Eine konstruktiv transformiert lytischen Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsbereich von Staphylococcus aureus und Penicillin-Bindungsprotein (PBP 2a)-Antikörper, konjugiert Latex-Kügelchen wurden verwendet, um einen Biosensor zur Diskriminierung von Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindlich (MSSA) S ausgelegt zu erstellen . aureus Arten ^1,2. Die lytische Phagen in Phagen Sphäroide wurde durch Kontakt mit Wasser-Chloroform-Schnittstelle umgewandelt. Phagen Sphäroid Monoschichten haben auf einem Biosensor Oberfläche wurde durch Langmuir-Blodgett (LB)-Technik ³ bewegt. Die angelegten Biosensoren nach einem Quarzkristall mit Dissipationsmessung Verfolgung (QCM-D), um Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen auswerten untersucht. Bakterien-Sphäroid Wechselwirkungen zu reduzierten Resonanzfrequenz und einem Anstieg in Dissipationsenergie sowohl für MRSA und MSSA Stämmen führte. Nach der bakteriellen Bindung haben diese Sensoren wurde weiter auf die Penicillin-bindende Protein Antikörper Latexperle ausgesetzts. Sensoren mit MRSA untersucht reagierte auf 2a Antikörper Perlen PBP, obwohl Sensoren mit MSSA inspiziert gab keine Antwort. Diese experimentelle Unterscheidung bestimmt eine eindeutige Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und sensiblen S. aureus-Stämme. Ebenso gebundenen und ungebundenen Bakteriophagen unterdrücken das Wachstum von Bakterien auf Oberflächen und in Wasser-Suspensionen. Sobald lytischen Phagen in Sphäroide geändert werden, behalten sie ihre starke lytische Aktivität und zeigen eine hohe bakterielle Capture-Funktion. Die Phagen und Phagen Sphäroide können für die Prüfung und Sterilisation von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verwendet werden. Andere Anwendungen können die Verwendung in Bakteriophagen-Therapie und antimikrobielle Oberflächen.

Einleitung

Methicillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus haben als ein Faktor in wesentlichen Infektionen und nosokomiale Ausbrüche ^4-8 vorgeschlagen worden. Gemeinsame Wege der Anerkennung von Methicillin-Resistenz, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions auf maßgeschneiderte Kulturbedingungen verlassen, um den Ausdruck des Widerstands zu verbessern. Änderungen umfassen die Verwendung von Oxacillin, Inkubation bei 30 oder 35 ° C statt 37 ° C, und die Aufnahme von NaCl zu dem Wachstumsmedium. Weiterhin für korrekte Erkennung durch diese Art von Techniken, eine lange Inkubationszeit von 24 h statt 16 bis 18 h erforderlich. Schnelle Techniken mit entsprechenden (> 96%) Empfindlichkeit für die Identifizierung von Methicillin-Resistenz sind automatisierte microdilution Techniken wie die Vitek GPS-SA-Karte, die Rapid-ATB Staph-System und Rapid Microscan Systemsteuerung System, Ergebnisse zu produzieren nach 3-11 h ^9-11. The Crystal MRSA ID-System ist ein schnelles Verfahren auf Anerkennung des Wachstums von S. basierend aureus in Gegenwart von 2% NaCl und 4 mg Oxacillin pro Liter mit einem Sauerstoff-sensitive Fluoreszenz-Sensor. Beansprucht Empfindlichkeiten im Bereich zwischen 91 bis 100% nach 4 h Inkubation ^12-14. Diese phänotypische Methoden sind in ihrer Genauigkeit durch die Auswirkungen der herrschenden Stämme, die heterogene Widerstand auszudrücken begrenzt. Daher ist die beste weithin akzeptierte Verfahren für die Anerkennung von Methicillin-Resistenz PCR oder DNA-Hybridisierung des mecA Gens ^15. Allerdings erfordert diese Technik gereinigt DNA und ist äußerst empfindlich gegenüber verschiedenen Beimischungen (Verunreinigungen), die Zelltrümmer ¹⁶ umfassen.

Darüber hinaus müssen diese Verfahren eine lange Zeit durchzuführen. Strategien, um die Anerkennung des mecA Genprodukt Protein PBP 2a, könnte genutzt werden, um den Widerstand zu bestimmen und kann zuverlässiger im Vergleich zu Standard-Test-Techniken ^17.

Es wurde bereits früher gezeigt, dass Bakteriophagen 12600 als Sonde zur Erkennung Staphylococcus aureus-Stämme, einschließlich solche, die Methicillin-Resistenz ^1,2,18 verwendet werden. In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, eine neue Technik in der spezifischen Erkennung und Erkennung von MRSA, wie die Anerkennung von Bakterien zusammen mit Konformation von MRSA in Echtzeit. Für diesen speziellen Zweck ein S. aureus Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsspektrum (einschließlich MRSA) mit einem monoklonalen Antikörper gegen Protein kombiniert (PBP 2a) verwendet wurden. PBP 2a eine Zellwandprotein und ist die Ursache von antibiotischen Widerstand von MRSA. Allerdings PBP 2a Antikörper ist nicht spezifisch für S. aureus seit einigen anderen Bakterien Antibiotika-bindende Proteine ​​mit Sequenzähnlichkeit zu PBP 2a ^19,20. Folglich in dieser Arbeit, S. aureus Bakteriophagen und Antikörper gegen PBP 2a Protein verwendet wurden. Um einen Biosensor zu entwickeln spezielltisch erkennen und zu identifizieren MRSA Ein Gerät mit einem zwei Schritten genutzt wurde. Der erste Schritt verwendet ein S. aureus Bakteriophagen Monoschicht als Sensor-Sonde, während der zweite Schritt PBP 2a spezifischen Antikörpern verwendet. Daher Schritt wird man erkennen, S. aureus Bakterien, als der andere empfindlich gegen das Antibiotikum-Bindungsprotein. Wenn Signale von zwei Schritten erhalten positiv sind, gibt es den spezifischen Nachweis von MRSA.

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Protokoll

1. Einstellen der Stage

1. Erhalten Typstamm S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 und Bacillus subtilis ATCC 6051. Methicillin-resistente Stämme von S. aureus - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Das lytische Phagen 12600.
2. Erhalten PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen.
3. Bereiten NZY Medium wie beschrieben ^21.
4. Erhalten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
5. Bereiten VE-Wasser als Subphase für Langmuir-Blodgett (LB)-Monoschicht Abscheidung.

2. Bakteriophagen Vermehrung und Titration

1. Inkubieren 5 ml Übernachtkultur von S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 ⁸ Kolonie bildenden Einheiten (KBE) / ml) mit 500 ul Phagen (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> PFU / ml) in 500 ml Medium in NZY 2 L Flack auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C über Nacht.
2. Zentrifuge bei 4.424 xg Kultur für 10 min bei 4 ° C.
3. Re zentrifugierten Überstand bei 11.325 × g für 10 min bei 4 ° C.
4. Filter Überstand durch ein 0,22 um Millipore-Filter.
5. Das Filtrat bei 75.395 xg für 1,5 Stunden.
6. Anschließend das Pellet in 100 ul destilliertem Wasser.
7. Bereiten 10fache Verdünnungen von Phagensuspension in NZY Medium.
8. Plate 1 ml über Nacht (ON) Kultur von S. aureus ATCC 12600 auf je 2 Platten mit NZY Agar sicherstellen, dass alle Oberfläche bedeckt ist. Entfernen Sie den Überschuss an Kultur und lassen die Oberfläche trocken für 30 min.
9. Spot eine Probe (10 ul) geeigneter Phagenverdünnung auf die Oberfläche der Platte und Inkubation bei ³⁷ ° C für 18-24 Std.
10. Untersuchen Sie die Bildung von Plaques und die Berechnung der Phagentiter. Bakteriophagen-Titer (T) auf der Grundlage der Anzahl von p geschätztLaques (N) je 10 ul Volumen (V) des Phagen Suspension und der Verdünnungsfaktor (F) gebildet ist. . T = N / (vxf) Beispiel für die Anzahl der Plaques 75 bei der Verdünnung 10 ^-7 und das Volumen 10 ul (10 x 10 ^-3 ml), ist der Titer gleich 75 /: Der Titer wurde durch Formel (10 x 10 ^-3 x 10 ^-7) = 7,5 x ¹⁰ 10 Plaque-bildende Einheiten (PFU) pro ml Suspension.

3. Gold-immobilisierten Phagen

1. Saubere goldbeschichteten Quarz Stück (60 mm ²⁾ durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min und dann für 6 Stunden sterilisieren unter UV-Licht in einem sterilen Gehäuse.
2. In 50 Mikroliter von 1 x 10 ⁹ PFU / ml Phagensuspension an die Goldoberfläche jedes Stückes in eine sterile Petrischale, und dann Inkubation über Nacht in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur.
3. Entfernen und die restlichen titrieren Phagensuspension.
4. Waschen Stücke mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS, um ungebundene entfernenPhagen.

4. Testen von immobilisiertem Phageninfektiosität auf eine trockene Oberfläche

1. Verbreiten Sie eine O / N-Kultur von S. Aureus ATCC 12600 auf eine NZY Agarplatte und trocknen lassen.
2. Legen Sie ein Goldstück mit immobilisierten Phagen auf die Platte nach unten.
3. Beobachten einer Zone der Lyse nach 12-stündiger Inkubation bei 37 ° C, die angibt Infektiosität.
4. Mit Gold bedeckt Stücke ohne Phagen in Kontrollversuche.

5. Prüfung der lytischen Aktivität der freien und gebundenen Phagen in Liquid

1. Hinzufügen eines ON Kultur von S. aureus ATCC 12600 bis 10 ml NZY in jeder von vier 300 ml-Kolben Seitenarm (6 x 10 ⁶ CFU / ml in jeden Kolben).
2. Hinzufügen In zwei Kolben 2 x 10 ⁶ PFU / ml des freien Phagen.
3. Mit den beiden anderen Kolben als Kontrollen.
4. Überwachen Sie den zeitlichen Verlauf der S. aureus Zelllyse für 570 min durch Messung der optischen Dichte (OD ₆₀₀₎ bei 30 min-Takt für alle Flaschen.
5. Nehmen Sie eine abschließende Messung nach 24 Stunden.
6. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.5, sondern verwenden Sie Goldstücke mit gebundenen Phagen anstelle des freien Phagen und Goldstücke ohne Phagen in Kontrolle Kolben.

6. Der Verlust der gebundenen Phagen während der Inkubation

1. In 50 ul 1 x 10 ⁹ PFU / ml Phagen auf der Oberfläche von sterilen Goldstück in einer Petrischale, die in einer feuchten Kammer über Nacht bei Raumtemperatur gelegt wird.
2. Entfernen Sie die Suspension mit ungebundenen Phagen aus der Goldoberfläche und Titer.
3. Waschen Sie das Goldstück mit gebundenen Phagen 5 mal mit PBS und in 1 ml NZY Lösung in 15 ml Tube im Shaker-Inkubator bei 37 ° C für 8 Stunden.
4. Bestimmen Sie den Titer der abgelösten Phagen wie in 2 beschrieben.

7. Phagen Spheroids Vorbereitung

1. Die Kombination 400 ul stock Phagen 12600 Suspension (10 ¹¹ PFU / ml) mit einem gleichen Volumen Chloroform spektrophotometrische Grad in 1 ml Fläschchenbei Raumtemperatur.
2. Vortexen die Phagen-Chloroform Suspension 5-6 mal (5 Sekunden-Intervallen) über eine Minute Dauer.
3. Erlaubt die Suspension für 30 sec stabilisieren und dann Pipettieren der oberen Phase, die Sphäroide off wurde Monolayer pipettiert.
4. Nehmen Sie ein paar Mikroliter der Sphäroide Suspension für die Übertragung und der Rasterelektronenmikroskopie.
5. Verwenden Sie einen verbleibenden Sphäroid Aufhängung für Biosensor Fertigung.

8. Biosensor Vorbereitung

1. Saubere QCM-D-Sensoren durch Plasma-Ätzen in Argon für 10 min PDC-32G Harrick Plasma cleaner.
2. Spülen Sensor mit Hexan keine organischen Verunreinigungen zu entfernen.
3. Vorbereiten und reinigen einen Trog des Films Gleichgewicht wie in ²² beschrieben.
4. Füllen LB Trog mit einer Subphase Lösung und reinigen Sie ihn mit einem Trog Barriere und stabilisieren die Mulde bei 20 ± 0,1 ° C
5. Verbreiten Sie 300 ul Aliquot des Phagen 12600 in wässrigen Susauf (10 ¹¹ PFU / ml) auf LB Subphase.
6. Bereiten Phagen Monoschicht auf LB Subphase Lösung, indem 300 ul Aliquots des Phagen 12600 wässrigen Suspension (10 ¹¹ PFU / ml) abzulaufen eine geneigte benetzbaren Glasstab, der teilweise in die Subphase ^22,23 eingetaucht ist.
7. Stabilisieren Sie die vorbereiteten Monoschicht für 10 min und dann komprimieren mit einer Geschwindigkeit von 30 mm / min (45 cm ² / min), bis ein konstanter Druck 19 N / m erreicht wird.
8. Führen einer vertikalen Schichtabscheidung auf senkrecht positioniert QCM-D-Sensor mit einer Geschwindigkeit von 4,5 mm / min durch aufeinanderfolgendes Eintauchen Sensor in die und aus der Monoschicht siebenmal. Elektronenmikroskopie abgeschieden Phagen Monoschichten vor der Exposition gegenüber bakteriellen Proben zeigten, daß die Schichten kontinuierliche, homogene und einheitliche (Daten nicht gezeigt) waren.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,8 mit einem Phagen Sphäroid Suspension in 3 hergestellt wird.
10. Verwenden hergestellt Phagen Biosensoren für die MRSA-Erkennung, ElektronenMikroskopie und Ellipsometrie.

9. Biosensor Testing, Diskriminierung von Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterien und Sensitive

1. In diesem Protokoll werden Biosensoren mit unmodifizierten und modifizierten Phagen und Phagen-Kügelchen hergestellt. Quarzkristall-Mikrowaage mit vier Sensor Strömungskammern dient zur Überwachung Bindung von Bakterien an die Phagen auf QCM Sensoroberfläche immobilisiert. PBP 2a Antikörper, konjugiert Latexkügelchen werden verwendet, um zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Alle Messungen werden in der Flow-Modus (50 ml / min) bei 5 MHz durchgeführt.
2. Stellen Sie eine Basislinie Resonanzfrequenz der QCM Sensor in Wasser (~ 30 min).
3. Zeichnen einer Suspension lebender Methicillin sensitive Staphylococcus Bakterienzellen in Wasser (10 ⁹ CFU / ml) durch die Testzelle.
4. Kontinuierliche Überwachung Änderungen in der Resonanzfrequenz und Sensoren Energiedissipation zum ersten Oberton, using der Q-Soft Software.
5. Wenn die Änderungen in der Resonanzfrequenz Sensoren und Dissipation Sättigung erreicht, fügen Sie die Aussetzung der PBP-Antikörper, konjugiert Latexkügelchen (6,77 x10 ¹⁰ Perlen / ml) auf die Strömung während der kontinuierlichen Überwachung von Frequenz und Verlustleistung.
6. Wiederholen Sie die Schritte 9,2-9,5 für Methicillin-resistenten Staphylococcus Bakterienzellen (MRSA).
7. Definieren Sie einen Frequenzwechsel durch die Masse Änderung durch Bakterien-Bindung durch die Sauerbrey-Gleichung Af = ^24,25-Dm xn / C, wobei C die Masse Empfindlichkeit konstant (C = 17,7 ng x cm ^-2 x Hz ^-1 bei 5 MHz ) m Masse und n die Anzahl Oberton (n = 1).
8. Definieren einer Energiedissipation Änderung (Δ D) von der Aufnahme der exponentiellen Abklingen der Schwingung (Frequenz und Amplitude dämpft, welche erlaubt die Quantifizierung der Energie abgeführt und während einer Periode der Oszillation gespeichert,E _abgeführt und E jeweils _gespeichert: Δ D = E _abgeführt / 2 πE _gespeichert. Δ D ist in Verlustleistung Einheiten (DU), eine DU = 10 ^-6 relative Einheiten) gemessen.

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Ergebnisse

Die Phagen zeigte lytische Aktivität gegen alle getesteten Stämme von S. aureus, einschließlich MRSA-Stämme, wie die Phagen-Spot-Test angegeben. Plaque Größen Regel reichten von 5 bis 15 mm. Wurde keine Aktivität gegen andere Test-Kulturen (Tabelle 1).

Ein normales Wachstum von S. aureus ATCC 12600 in NZY Mediums auf Schüttler-Inkubator bei 37 ° C ist in Abbildung 1A (eine Kurve durch leere Kreise gekennzeichnet) gezeigt. Die Anzah...

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Diskussion

Es ist bekannt, dass Phagen als Biosensor Sonden für bakterielle Erreger ²⁸ verwendet werden. Es wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagen zusammen mit PBP 2a Antikörper genutzt werden, um das alte Problem zu lösen: schnelle Diskriminierung antibiotikaresistenten und empfindliche Stämme.

Es wurde gefunden, jedoch diese normale unveränderte Staphylokokken Phagen nicht geeignet sind für Bakterien Detektion mit QCM Geräte, obwohl sie Bakterien binden. Die Phagen-Schwanz ist s...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools