Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus

Резюме

Литические биосенсоров фага и антител шариков, способных различать устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительных бактерий стафилококка. Фаги обездвижен Ленгмюра-Блоджетт на поверхность кварцевых датчиков микровесах кристалла и работала широкая зонды стафилококком диапазоне. Антитела бисера признать MRSA.

Аннотация

Структурно преобразован литических бактериофагов, имеющего широкий круг хозяев штаммов золотистого стафилококка и пенициллин-связывающих белков (ПСБ 2а) антитела, конъюгированного латексных были использованы для создания биосенсоров предназначен для дискриминации устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительные (MSSA) S . ^1,2 золотистый вид. Литические фаги были преобразованы в фаг сфероидов при контакте с водой и хлороформом интерфейс. Фаговые сфероидом монослоя были перемещены на поверхности биосенсора Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) техника ^3. Созданный биосенсоров, были рассмотрены кварцевых микровесов с диссипацией слежения (QCM-D), чтобы оценить бактерий-фаг взаимодействий. Бактерии-сфероида взаимодействий привело к снижению резонансной частоты и увеличение диссипации энергии для MRSA и MSSA штаммов. После того, как бактериальный связывания, эти датчики были дополнительно подвергают пенициллин-связывающего белка антител латексный шарикс. Датчики проанализированы с MRSA ответил на PBP бисера 2а антител, хотя датчики проверены с MSSA не дал никакого ответа. Этот экспериментальный различие определяет однозначную дискриминации между метициллин устойчивый и чувствительный S. стафилококк штаммов. Не менее связанными и несвязанными бактериофаги подавляют рост бактерий на поверхностях и в воде суспензии. После литические фаги превратился сфероидами, они сохраняют свою сильную литической активностью и показывают высокую бактериальную возможности захвата. Фага и фаг сфероиды могут быть использованы для тестирования и стерилизации устойчивых к антибиотикам микроорганизмов. Другие приложения могут включать в себя использование в терапии бактериофаг и противомикробные поверхностей.

Введение

Устойчивые к метициллину штаммы золотистого стафилококка были предложены в качестве фактора в необходимых инфекций и внутрибольничных вспышках ^4-8. Обычные способы признания устойчивость к метициллину, такие как диск диффузии оксациллином кинопробы агар или бульон микроразведений, рассчитывать на индивидуальные условия культивирования для усиления экспрессии сопротивления. Изменения включают использование оксациллин, инкубация при 30 или 35 ° C, чем 37 ° С, и включение NaCl в среде роста. Кроме того, для правильного определения этих видов техники, длительный период инкубации 24 ч вместо 16 до 18 часов не требуется. Быстрое методы с соответствующим (> 96%) уровень чувствительности для идентификации устойчивость к метициллину включать автоматизированных методов микроразбавления такие как Vitek GPS-SA карты, Быстрое ATB Staph системы и быстрой панели Microscan системы, которые производят результаты после 3-11 часов ^9-11. Кристалл MRSA ID системы является быстрое метод, основанный на признании роста S. стафилококк в присутствии 2% NaCl и 4 мг на литр оксациллин с чувствительных к кислороду флуоресценции датчика. Заявленное чувствительностью в диапазоне от 91 до 100% через 4 часа инкубации ^12-14. Эти фенотипические методы ограничены в своей точности под воздействием распространенных штаммов, которые выражают гетерогенных сопротивления. Поэтому лучший широко принятыми методами для признания устойчивость к метициллину является ПЦР или гибридизации ДНК гена MÉCA ^15. Однако этот метод требует очищенной ДНК и чрезвычайно чувствительны к различным примесей (примеси), которые включают ¹⁶ клеточного дебриса.

Кроме того, эти методы требуют длительного времени для выполнения. Стратегии, направленные на признание продукта Мека ген, белок PBP 2a, могут быть использованы для определения сопротивления и может быть более надежным по сравнению со стандартными методами тесте ^17.

Оно было ранее показано, что бактериофаг 12600 может быть использован в качестве зонда для признания золотистого стафилококка штаммы том числе те, метициллин сопротивление ^1,2,18. В данной работе предложен новый метод в специфическое распознавание и обнаружение MRSA, такие как признание бактерии вместе с конформацией MRSA в реальном времени. Для этой цели С. стафилококк бактериофаг с широким спектром хозяев (включая штаммы MRSA) в сочетании с моноклональными антителами против белка (PBP 2a), были использованы. PBP 2a является белком клеточной стенки, и это является причиной сопротивления антибиотикам MRSA. Однако PBP 2a антитело не является специфичным для S. стафилококка, так как некоторые другие бактерии антибиотиками связывающих белков с последовательностью сходство с PBP 2a ^19,20. Следовательно, в данной работе С. бактериофаг стафилококк и антитела против белка 2а PBP были использованы. Для того, чтобы разработать для биосенсора спецификациически обнаружения и идентификации MRSA устройство с двухступенчатым действием была использована. Первым шагом использованы С. стафилококк бактериофаг монослой как выходной сигнал с датчика, а на втором этапе используют PBP 2a специфических антител. Таким образом, первый этап будет признать С. стафилококк бактерии, а другая будет чувствителен к антибиотику-связывающий белок. Когда сигналы, получаемые от двух шагов положительны, указывает конкретный обнаружения MRSA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Создание основы

1. Получение штамма S. стафилококк АТСС 12600, С. стафилококк АТСС 27690 и Сенная палочка АТСС 6051. Метициллин-резистентных штаммов S. стафилококк - MRSA1, MRSA 2, 5 MRSA, MRSA 13, 26 MRSA, MRSA 34, 45 MRSA, Б. сибирской язвы Sterne, Salmonella Typhimurium LT2, шигеллы Флекснера, Yersinia enterocolotica, Proteus Mirabilis, клебсиелла пневмонии 13882; литических фагов 12600.
2. Получить PBP 2a антитела, конъюгированного латексных.
3. Подготовка NZY среде, как описано ^21.
4. Получение забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).
5. Подготовьте деионизированной воды как для субфазы Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ) монослоя осаждения.

2. Распространение и титрование бактериофага

1. Выдержите 5 мл ночной культуры С. стафилококк АТСС 12600 (3.6 х 10 ⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл), 500 мкл фага (3 × 10 ^{9 <}/ Вир> PFU / мл) в 500 мл NZY среды в 2 л Флэк на шейкере-инкубаторе при 37 ° С в течение ночи.
2. Центрифуга культуры в 4424 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
3. Повторное супернатант центрифугировали при 11325 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
4. Фильтр супернатанта через 0,22 мкм фильтр Millipore.
5. Центрифуга фильтрата при 75 395 мкг в течение 1,5 часов.
6. Растворить осадок в 100 мкл дистиллированной воды.
7. Подготовка 10-кратного разведения фага суспензии в NZY среды.
8. Пластина 1 мл на ночь (ON) культуры С. стафилококк АТСС 12600 на каждую из 2 пластин с NZY агар убедиться, что все поверхности покрыта. Удаления избытка культуры и дать поверхности высохнуть в течение 30 мин.
9. Определить образец (10 мкл) из соответствующего разведения фага на поверхность пластины и инкубировать при 37 ° ^С в течение 18-24 часов.
10. Изучите образованию бляшек и рассчитать титр фага. Бактериофаг титры (Т), оцениваются на основе количества рLaques (N), образованный в 10 мкл объема (объем) суспензии фага и коэффициент разбавления (F). Титр рассчитывали по формуле:. Т = N / (VXF) Например, для количества бляшек 75 при разведении 10 ^-7 и объемом 10 мкл (10 × 10 ^-3 мл) Титр равна 75 / (10 × 10 ^-3 × 10 ^-7) = 7,5 · 10 ¹⁰ бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл суспензии.

3. Gold-иммобилизованных Фаговые

1. Чистый золотым покрытием кварцевым части (60 мм ^2), плазменного травления в атмосфере аргона в течение 10 мин и затем стерилизуют в течение 6 часов под УФ-светом в стерильной камере.
2. Добавьте 50 мкл 1 × 10 ⁹ БОЕ / мл фагового подвески с поверхностью золота каждой части в стерильную чашку Петри, а затем инкубировать в течение ночи во влажной камере при комнатной температуре.
3. Удалите и титровать оставшиеся подвески фага.
4. Вымойте части со связанными фага в 5 раз с PBS для удаления несвязанныхфага.

4. Тестирование Иммобилизованный Фаговые Инфекционность на сухой поверхности

1. Распространение O / N культуры с. Золотистый АТСС 12600 на NZY пластины агара и дать высохнуть.
2. Поместите золотую монету с иммобилизованными фага на тарелку лицом вниз.
3. Заметим зону лизиса после 12 ч инкубации при 37 ° С, что указывает на инфекционность.
4. Использование золота покрыты части, не фага в контрольных экспериментах.

5. Тестирование литической активности свободных и связанных Фаговые в жидком

1. Добавить по культуре С. стафилококк АТСС 12600 в 10 мл NZY в каждом из четырех 300-мл колбы пистолет (6 × 10 ⁶ КОЕ / мл в каждую колбу).
2. Добавить В двух колбах 2 х 10 ⁶ PFU / мл свободного фага.
3. Использование других двух колбах в качестве контроля.
4. Следить за ходом времени С. стафилококк лизис клеток на 570 минут на измерение оптической плотности (ОП ₆₀₀₎ на 30 минутные интервалы для всех колбах.
5. Принять окончательное измерение в 24 часов.
6. Повторите шаги 5.1-5.5, но и использовать золотые монеты со связанными фагов вместо свободного фагов, и золотых монет, не фага в контрольных колбах.

6. Потери связанные фаги во время инкубации

1. Добавьте 50 мкл 1 × 10 ⁹ БОЕ / мл фага на поверхности стерильный кусок золота в чашке Петри, который помещен в влажной камере в течение ночи при комнатной температуре.
2. Снимите подвеску с несвязанными фага с поверхности золота и титр.
3. Промыть золото кусок со связанными фаг 5 раз PBS и место в 1 мл NZY раствора в 15 мл пробирку в шейкере-инкубаторе при 37 ° С в течение 8 часов.
4. Определить титр фага отдельно, как описано в пункте 2.

7. Подготовка Фаговые Сфероиды

1. Сочетание 400 мкл запас фага 12600 суспензии (10 ¹¹ PFU / мл) с равным объемом хлороформа спектрофотометрического класса в 1 мл флаконепри комнатной температуре.
2. Аккуратно вихрь фаг-хлороформ подвески 5-6 раз (5 сек интервалами) в течение одной минуты продолжительности.
3. Допускается подвеска стабилизироваться в течение 30 секунд, после чего пипеткой верхней фазы, содержащей сфероидами был пипеткой для монослоя подготовки.
4. Потратьте несколько мкл сфероидами подвески для передачи и сканирующей электронной микроскопии.
5. Используйте оставшиеся сфероидом суспензия для биосенсоров производства.

8. Подготовка биосенсоров

1. Чистый QCM-D датчикам плазменного травления в среде аргона в течение 10 мин PDC-32G чистых Harrick плазмы.
2. Промыть датчик с гексаном, чтобы удалить любые органические примеси.
3. Подготовьте и очистите корыто фильма баланса, как описано в ^22.
4. Заполните ЛБ-ванной с субфазы раствором и протрите его через барьер и стабилизации корыта при температуре 20 ± 0,1 ° C
5. Распространение 300 мкл аликвоты фага 12600 в водных suspensiна (10 ¹¹ PFU / мл) на LB субфазы.
6. Подготовьте фага монослоя на LB субфазы решение, позволив 300 мкл аликвоты фага 12600 водной суспензии (10 ¹¹ PFU / мл), чтобы запустить по наклонной смачивающийся стеклянную палочку, которая частично погружают в субфазы ^22,23.
7. Стабилизация подготовленную монослое в течение 10 мин, а затем сжать его со скоростью 30 мм / мин (45 см ² / мин), для достижения постоянного давления 19 Н / м, не будет достигнута.
8. Выполнение вертикального осаждения пленки на перпендикулярную расположены QCM-D датчик со скоростью 4,5 мм / мин путем последовательного погружения датчика в и из монослой семь раз. Электронно-микроскопическое исследование хранение фага монослоев перед воздействием бактериальных образцов показал, что слои были непрерывными, однородный и равномерный (данные не показаны).
9. Повторите шаги 4.5-4.8 с фагом сфероид суспензии, которую получают 3.
10. Используйте сфабрикованы фага биосенсоров для обнаружения MRSA, электронмикроскопии и эллипсометрии.

9. Тестирование биосенсоров, Дискриминация метициллин устойчивый и чувствительных бактерий Staphylococcus

1. В этом протоколе биосенсоров с немодифицированных и модифицированных фагов и фаг сфероиды подготовлены. Кварцевых микровесов на основе кристалла с четырех камер датчика потока используется для контроля связывание бактерий фагом иммобилизованного на поверхности QCM датчика. PBP 2a антитела, конъюгированного латексных используются различать устойчивые к метициллину (MRSA) и чувствительных бактерий стафилококка. Все измерения проводятся в режиме потока (50 мкл / мин) на частоте 5 МГц.
2. Создание базовой линии резонанса частота QCM датчик в воде (~ 30 мин).
3. Нарисовать суспензии живых чувствительные к метициллину стафилококками бактериальных клеток в воде (10 ⁹ КОЕ / мл) через испытательную камеру.
4. Непрерывный мониторинг изменений в частоте резонанса и датчики диссипации энергии для первого обертона, УЗИнг Q-Soft программного обеспечения.
5. Когда изменения в частоте резонанса датчиков и диссипации достиг точки насыщения, добавьте приостановлении PBP антитела, конъюгированного латексных (6,77 x10 ¹⁰ бисер / мл) в потоке во время непрерывного мониторинга частоты и тепла.
6. Повторите шаги 9,2-9,5 для метициллин устойчивый золотистый бактериальных клеток (MRSA).
7. Определить изменение частоты через изменение массы из-за бактерий обязательным уравнением Sauerbrey ^24,25 Δf = Ат-хп / C, где С-постоянная чувствительность масс (C = 17,7 нг х х см ^{-2 -1} Гц на частоте 5 МГц ), М-масса и N является обертона числа (N = 1).
8. Определить изменение рассеяния энергии (Δ D) от записи экспоненциальное затухание колебаний (частоты и амплитуды увлажнения, что позволило количественно энергии, рассеянной и хранятся в течение одного периода колебаний,E _{рассеивается} и Е _{сохраняются} соответственно: D = Δ E _{рассеивается} / 2 πE _{сохранены.} Δ D измеряется в единицах диссипации (DU), один Ду = 10 ^-6 относительных единицах).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Фага продемонстрировали литическую активность в отношении всех протестированных штаммов S. стафилококка, включая MRSA штаммов, о чем свидетельствуют капельного теста фага. Зубной налет размеров обычно составлял от 5 до 15 мм. Нет активность была обнаружена в отношении других тест-ку?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хорошо известно, что фаги могут быть использованы в качестве зондов для биосенсора бактериальных патогенов ^28. Как показано в этой работе, что фаг вместе с антителами PBP 2a может быть использован для решения старой проблемы: быстрое дискриминации устойчивых к антибиотикам и чувств?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools