Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

Özet

Litik faj biyosensörler ve antikor boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt edebiliyoruz. Faj bir kuvars kristal mikro sensörünün bir yüzey üzerine Langmuir-Blodgett yöntemi ile hareketsiz ve geniş stafilokok prob olarak çalışıyordu. Antikor boncuk MRSA tanır.

Özet

Staphylococcus aureus suşları arasında, geniş bir konak yelpazesi ve penisilin-bağlayıcı protein (PBP 2a) konjuge antikor lateks boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı (MSSA), S ayrımı için tasarlanmış bir biyosensor oluşturmak için kullanılmıştır sahip olan bir yapısal dönüştürülmüş litik bakteriyofajı . aureus türleri ^1,2. Litik faj su-kloroform arayüzü ile temas ile faj parçacıklarının dönüştürülmüştür. Faj sfero mono tabakaları Langmuir-Blodgett (LB) tekniği ³ ile bir biyosensör yüzeye taşınmıştır. Oluşturulan biyosensörler bakteri-faj etkileşimleri değerlendirmek dağılımını izleme ile bir kuvars kristal mikro (QCM-D) tarafından incelenmiştir. Bakteri-sfero etkileşimleri düşük rezonans frekansı ve MRSA ve MSSA suşları hem de dağılımı enerji artmasına neden olmuştur. Bakteriyel olarak bağlandıktan sonra, bu sensörler daha penisilin bağlayıcı protein antikor lateks boncuk maruz kalmışs. MRSA ile analiz sensörleri 2a antikor boncuk PBP yanıt; MSSA ile kontrol sensörleri cevap verdi rağmen. Bu deneysel ayrım metisilin dirençli ve duyarlı S. arasında kesin bir ayrım belirler aureus suşları. Aynı şekilde bağlı ve ilişkisiz bakteriyofajlar yüzeylerde ve su süspansiyonlar bakteriyel büyüme bastırmak. Litik faj parçacıklarının dönüştürülür sonra, onlar güçlü litik aktivite korumak ve yüksek bakteri yakalama özelliği göstermektedir. Faj ve faj parçacıklarının antibiyotik dirençli mikroorganizmaların test ve sterilizasyon için kullanılabilir. Diğer uygulamalar bakteriyofaj tedavisi ve antimikrobiyal yüzeylerinde kullanılmasını içerebilir.

Giriş

Staphylococcus aureus metisilin dirençli suşlar temel enfeksiyonları ve hastane salgınları ^4-8 bir faktör olarak öne sürülmüştür. Bu disk difüzyon oksasilin agar tarama testi veya sıvı mikrodilüsyon olarak metisilin direnci tanınması ortak yolları, direnç ifade geliştirmek için özel kültür koşulları güveniyor. Değişiklik oksasilin kullanımı ° C yerine 37 ° C den 30 ya da 35 de inkübasyon ve büyüme ortamı NaCl dahil bulunmaktadır. Ayrıca, bu tür teknikler ile doğru bir şekilde tespiti için, 24 saatlik uzun bir kuluçka süresi yerine, 16-18 saat arasında gereklidir. Metisilin direncinin belirlenmesi için hassasiyet uygun (>% 96) düzeyde hızlı teknikleri 3-11 saat sonra sonuçlar bu Vitek GPS-SA kart, Hızlı ATB Staph sistemi ve hızlı Microscan Panel sistemi olarak otomatik mikrodilüsyon teknikler şunlardır ^9-11. Kristal MRSA ID sistemine S. büyüme tanınması üzerine dayanan, hızlı bir yöntemdir 2% NaCl ve bir oksijen-duyarlı floresan sensörlü litre başına oksasilin, 4 mg varlığında aureus. İddia hassasiyetleri kuluçka ^12-14 4 saat sonra 91 ile 100 arası arası% değişir. Bu fenotipik yöntemler heterojen direnci ifade yaygın suşların etkisini kendi doğruluk sınırlıdır. Bu nedenle, metisilin direnci tanınması için en iyi yaygın olarak kabul yöntemleri mecA geninin ¹⁵ PCR veya DNA hibridizasyon olduğunu. Ancak bu teknik saflaştırılmış DNA gerektirir ve hücre artıkları ¹⁶ dahil çeşitli katkı maddeleri (yabancı madde), karşı son derece duyarlıdır.

Ayrıca, bu teknikler gerçekleştirmek için uzun zamana ihtiyacım var. MecA gen ürünü, protein PBP 2a, tanınması için stratejiler direncini belirlemek için yararlanılabilir ve standart test teknikleri ¹⁷ göre daha güvenilir olabilir.

Daha önce bakteriyofaj 12600 metisilin direnci ^1,2,18 sahip olanlar dahil olmak üzere, Staphylococcus aureus suşları için bir tanıma prob olarak kullanılabilir olduğu ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada bu tür gerçek zamanlı olarak MRSA uyum ile birlikte bakterilerin tanınması olarak MRSA özel tanıma ve algılama yeni bir teknik, önerdi. Bu amaç bir S. proteinine karşı bir monoklonal antikor ile birlikte barındıran çok geniş bir yelpaze (MRSA suşlar dahil) ile aureus bakteriyofaj (PBP 2a) kullanılmıştır. PBP 2a bir hücre duvarı protein ve MRSA antibiyotik direnç nedenidir. Ancak PBP 2a antikor S. için spesifik değildir diğer bazı bakterilerin bu yana aureus PBP 2a ^19,20 için dizin benzerliği olan antibiyotik bağlayıcı proteinler var. Sonuç olarak bu çalışmada, S. PBP 2a proteinine karşı aureus bakteriyofaj ve antikorlar kullanılmıştır. Specifi bir biyosensör geliştirmek edebilmek için,Cally'nin iki aşamalı bir işlem kullanılmıştır olan bir cihaz tespit ve MRSA belirlemek. İlk adım, S. kullanılan bir sensör probu olarak aureus bakteriyofaj tek tabaka, ikinci adım PBP 2a spesifik antikorların istihdam ederken. Bu nedenle, S. tanır adım aureus bakteriler, diğer biri olarak antibiyotik bağlayıcı protein duyarlı olacaktır. Iki adım alınan sinyalleri olumlu olduğunda, MRSA özel algılama gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Sahne Ayarlama

1. Tip suşu S. elde aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 ve Bacillus subtilis ATCC 6051. S. Metisiline dirençli suşlar aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; litik faj 12600.
2. PBP 2a antikor konjuge lateks boncuk alın.
3. ²¹ açıklandığı gibi NZY ortamı hazırlayın.
4. Fosfat elde edilir tuzlu su çözeltisi (PBS).
5. Langmuir-Blodgett (LB) tek tabaka birikimi için subphase olarak deiyonize su hazırlayın.

2. Bakteriyofaj Yayılım ve Titrasyon

1. S. gecelik kültürü, 5 ml inkübe faj 500 ul (3 aureus ATCC 12600 (3.6 x 10 ⁸ koloni oluşturan birim (CFU) / ml) x 10 ^{9 <}/ 37 ° C de bir gece boyunca çalkalayıcı enkübatörde üzerinde 2 L Flack 500 mi NZY ortamı içinde)> PFU / ml 'sup.
2. 4 10 dakika boyunca 4,424 x g'de santrifüjleyin kültür ° C
3. 4 10 dakika için 11,325 x g'de yeniden santrifüje süpernatant ° C
4. 0.22 um bir Millipore filtresi aracılığıyla filtre yüzer madde toplandı.
5. 1.5 saat 75.395 xg'de süzüntü santrifüj.
6. Damıtılmış su ve 100 ul pelet çözülür.
7. NZY ortamı içinde faj süspansiyonunun 10-kat seyreltim dizileri hazırla.
8. S. gece (ON) kültür plakası 1 ml Tüm yüzey kaplıdır emin olmak için NZY agar ile 2 plakaların her üzerine aureus ATCC 12600. Kültür aşırı çıkarın ve 30 dakika boyunca yüzey kurumaya bırakın.
9. Plaka yüzeyine uygun faj seyreltme bir örnek (10 ul) Nokta ve 18-24 saat süreyle 37 ^o C'de inkübe edin.
10. Plakların oluşumu inceleyin ve faj titresi hesaplar. Bakteriyofaj titresi (T) p sayısı olarak tahmin edilmiştirLaques (K), faj süspansiyon ve seyreltme faktörü (F), 10 ul hacmi (V) gerçekleştirilmelidir. . T = N / (VXF) Örneğin, 10 seyreltme ^-7 plakların sayısı 75 ve hacmi 10 ul (10 x 10 ^-3 mi), titresi 75 / eşittir: titre formül vasıtasıyla hesaplandı (10 x 10 ^-3 x 10 ^-7) = 7.5 x 10 ¹⁰ plak oluşturan birim (PFU) başına ml süspansiyon.

3. Altın hareketsiz Phage

1. Sonra 10 dakika argon içinde aşındırma ve plazma ile temiz altın kaplı kuvars parçaları (60 mm ²⁾ steril bir kabine UV ışık altında 6 saat sterilize edin.
2. Steril bir Petri kabındaki her parçanın altın yüzeyi 1 x 10 ⁹ PFU / ml faj süspansiyonunun 50 mikrolitre ekleyin ve daha sonra oda sıcaklığında bir gece boyunca nemli bir oda içerisinde inkübe edilir.
3. Kalan faj süspansiyonunun çıkarın ve titreleri.
4. Ilişkisiz kaldırmak için PBS ile bağlı faj ile adet 5 kez yıkayınfaj.

4. Bir Kuru Yüzey üzerinde İmmobilize Phage enfektivite test edilmesi

1. Bir NZY agar plaka üzerine S. Aureus ATCC 12600 bir O / N kültürünü yaymak ve kurumasını bekleyin.
2. Plaka yüzüne hareketsiz faj ile bir altın parçası aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
3. 37 12 saat inkübasyondan sonra lizis bir bölge dikkat ° C olan enfeksiyon gösterir.
4. Kontrol deneylerinde herhangi bir faj ile kaplı altın parçaları kullanır.

5. Sıvı Ücretsiz ve Bağlı Phage bir Parçalayıcı Faaliyet Test

1. S. bir ON kültürü ekle Dört adet 300 mL'lik şişeler, her (6 x 10 ⁶ CFU / her bir şişe içerisinde ml) içinde NZY arasında aureus ATCC 12.600-10 ml.
2. Iki şişe 2 x 10 ⁶ PFU / ücretsiz faj ml ekleyin.
3. Kontrol olarak, diğer iki şişelerde.
4. S. zaman ders izleyin Tüm şişeler için 30 dakika aralıklarla optik yoğunluk ölçümü (OD ₆₀₀₎ ile 570 dakika aureus hücre parçalama.
5. 24 saat bir son ölçüm yapın.
6. Adımları 5.1-5.5 tekrarlayın, ancak kontrolü şişeler hiçbir faj ile altın bağlı faj yerine ücretsiz fajlarla parçaları ve altın parçaları kullanın.

6. Kuluçka sırasında Bağlı Fajlar kaybı

1. Oda sıcaklığında gece boyunca nemli bir oda içine yerleştirilen bir petri steril altın parçası yüzeyi üzerine 1 x 10 ⁹ PFU / ml faj 50 ul ekle.
2. Altın yüzey ve titre gelen ilişkisiz faj ile süspansiyon çıkarın.
3. 8 saat boyunca 37 ° C de 5 saat ve PBS ile bir yerde çalkalayıcı enkübatörde 15 ml tüp içinde 1 ml çözelti içinde NZY bağlı faj ile altın parçası yıkayın.
4. 2'de tarif edildiği gibi müstakil faj titresi belirlenir.

7. Faj sferoidler Hazırlık

1. 1 ml'lik bir şişe içinde spektrofotometrik dereceli kloroform eşit hacmi ile stok faj 12600 süspansiyonu (10 ¹¹ PFU / ml) 400 ul birleştirenoda sıcaklığında karıştırıldı.
2. Yavaşça girdap 5-6 kez (5 sn aralıklarla) bir dakika süresi boyunca faj-kloroform süspansiyon.
3. 30 saniye için stabilize ve daha sonra parçacıklarının tek tabaka hazırlanması için kapalı pipetlendi içeren üst faz pipetle için süspansiyon izin verdi.
4. Iletim ve taramalı elektron mikroskobu için, söz konusu sferoidler süspansiyonu birkaç mikrolitre al.
5. Biyosensör üretimi için bir kalan sfero süspansiyon kullanın.

8. Biyosensör Hazırlık

1. 10 dakika PDC-32G Harrick plazma temizleyici için argon içinde aşındırma plazma tarafından temiz QCM-D sensörleri.
2. Herhangi bir organik kirleri çıkarmak için hekzan ile sensör durulayın.
3. Hazırlayın ve ²² olarak tarif edilen filmin bir denge çukur temizleyin.
4. Bir subphase çözüm LB çukur doldurun ve bir çukur bariyer ile temiz ve 20 çukur stabilize ± 0.1 ° C
5. Sulu suspensi içinde faj 12600 300 ul kısım yayınLB subphase üzerine (10 ¹¹ PFU / ml) üzerinde.
6. Kısmen subphase ^22,23 içine batık bir eğimli ıslanır cam çubuk aşağı çalıştırmak için faj 12600 sulu süspansiyon 300 ul kısım (10 ¹¹ PFU / ml) izin vererek LB subphase çözüm üzerine faj tek tabaka hazırlayın.
7. 10 dakika süre ile hazırlanan tek katmanlı stabilize edilmesi ve daha sonra, sabit bir basınç kadar, 19 N / m elde edilir, 30 mm / dakika (45 cm ² / dak) arasında bir hızda bunu sıkıştırmak.
8. Arda tek tabaka yedi kez sensör daldırma ve dışarı ile 4,5 mm / dak hızında dik konumlandırılmış QCM-D sensör üzerine dikey bir film biriktirme gerçekleştirin. Bakteriyel numuneleri maruz tabakalar (veriler gösterilmemiştir), sürekli homojen ve homojen olduğunu göstermiştir önce elektron mikroskopisi faj mono tabakaları yatırılır.
9. Tekrar 3 hazırlanmış bir faj sfero süspansiyon ile 4.5-4.8 adımları.
10. MRSA tespit, elektron için fabrikasyon faj biyosensörler kullanınmikroskopi ve elipsometri.

9. Biyosensör Test, Metisiline Dirençli Ayrımcılığın ve Hassas Stafilokok Bakteriler

1. Bu protokol, değiştirilmemiş ve modifiye faj ve faj parçacıklarının ile biyosensör hazırlanır. Dört sensör akış odaları olan bir kuartz kristali mikro QCM algılayıcı yüzeyi üzerinde hareketsiz faj bakteri bağlama izlemek için kullanılır. PBP 2a antikor konjuge lateks boncuk metisiline dirençli (MRSA) ve duyarlı stafilokok bakterileri ayırt için kullanılmaktadır. Bütün ölçümler, 5 MHz'de akış modu (50 ul / dak) yürütülmektedir.
2. Su (~ 30 dakika) en QCM sensör bir temel çizgi rezonans frekansı kurmak.
3. Test hücre yoluyla su canlı metisiline duyarlı stafilokok bakteri hücrelerinin (10 ⁹ CFU / ml) bir süspansiyon çizin.
4. Sürekli birinci aşırı ton, USI için sensörler rezonans frekans ve enerji dağılımı değişiklikleri izlemekng Q-Soft yazılım.
5. Sensörlerin rezonans frekansı ve dağılımı değişiklikleri doyma seviyeleri ulaştığı zaman, frekans ve yayılımın sürekli izlenmesi sırasında akış PBP antikor konjuge lateks boncuk (6,77 x10 ¹⁰ boncuk / ml) süspansiyonu ilave edin.
6. Tekrar metisiline dirençli stafilokok bakteri hücrelerinin (MRSA) için 9.2-9.5 adımları.
7. C sabiti (C = 17,7 ng x cm ^-2 x Hz ^-1 az 5 MHz kitle hassasiyeti olan Sauerbrey denklemi ^24,25 mesafe kadar taşınmış =-Δm xn / C, bağlayıcı bakteriler nedeniyle kitle değişiklik yoluyla bir frekans değişimi tanımlayın ), kütle m ve n, aşırı ton sayısı (n = 1) 'dir.
8. Kayıt bir enerji dağılımı değişimi (Δ D) tanımlayın salınım üstel çürüme (frekans ve genlik salınım biri döneminde harcanmış ve depolanan enerji miktarının izin hangi, nemlendirme,Sırasıyla, E _harcanmış ve E _saklanır: Δ D = E _harcanmış / 2 πE _saklanır. Δ D dağılımı birimi (DU), bir DU = 10 ^-6 göreceli adet) olarak ölçülür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Faj S. test edilen tüm suşlarına karşı litik aktivite göstermiştir olarak faj spot test ile gösterilir MRSA suşları da dahil olmak üzere aureus,. Plak boyutları genellikle 5 ile 15 mm arasındadır. Aktivite diğer test-kültürler (Tablo 1) karşı bulunamadı.

S. A normal büyüme 37 çalkalayıcı-inkübatör NZY ortamda aureus ATCC 12600 ° C Şekil 1A (boş çevreler tarafından etiketli bir eğri) göster...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu fajlar de bakteriyel patojenler için ²⁸ biyosensör problar olarak kullanılabilir bilinmektedir. Hızlı ayrımcılık antibiyotik dirençli ve duyarlı suşlar: Bu PBP 2a antikorlar ile birlikte faj eski sorunu çözmek için kullanılabilir bu çalışmada gösterilmiştir.

Ancak, bu normal bir değiştirilmemiş stafilokok fajlar bakteri bağlama bile, QCM cihazlarla bakteri tespiti için uygun değildir bulunmuştur. Faj kuyruk akustik dalgaların faj kuyrukları sonuna k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools