Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

Résumé

Biocapteurs de phages lytiques et des perles d'anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d'un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d'anticorps reconnaissent SARM.

Résumé

Un bactériophage lytique structurellement transformée ayant un large spectre d'hôte des souches de Staphylococcus aureus et une protéine liant à la pénicilline (PBP 2a) anticorps billes de latex conjuguées ont été utilisées pour créer un biocapteur conçu pour discrimination résistant à la méthicilline (SARM) et sensible (SASM) S . espèces ^de Staphylococcus ^1,2. Les phages lytiques ont été transformés en sphéroïdes phages par le contact avec l'interface eau-chloroforme. Phage monocouches sphéroïde ont été déplacés sur une surface du biocapteur par Langmuir-Blodgett (LB) technique ^3. Les biocapteurs créés ont été examinés par une microbalance à cristal de quartz avec un suivi de dissipation (QCM-D) pour évaluer les interactions bactéries-phages. Interactions bactéries-sphéroïde conduit à la fréquence de résonance réduite et une augmentation de la dissipation d'énergie pour les deux souches de SARM et SASM. Après la liaison bactérienne, ces capteurs ont été plus exposées à l'anticorps protéine liant à la pénicilline perles de latexs. Capteurs analysés par le SARM ont répondu à PBP 2a perles d'anticorps, bien capteurs inspectés avec MSSA donné aucune réponse. Cette distinction expérimentale détermine une discrimination claire entre résistant à la méthicilline et S. sensible souches de Staphylococcus. Également liées et non liées bactériophages supprimer la croissance bactérienne sur les surfaces et dans les suspensions de l'eau. Une fois phages lytiques sont changés en sphéroïdes, ils conservent leur activité lytique forte et montrent une grande capacité de capture bactérienne. Les phages et les phages sphéroïdes peuvent être utilisés pour les essais et la stérilisation des micro-organismes résistant aux antibiotiques. D'autres applications peuvent inclure l'utilisation en thérapie bactériophage et surfaces antimicrobiennes.

Introduction

Souches résistantes à la méthicilline de Staphylococcus aureus ont été suggérés comme un facteur dans les infections et les épidémies nosocomiales essentielles ^4-8. Les moyens ordinaires de la reconnaissance de la résistance à la méticilline, comme la diffusion test de disque d'oxacilline d'agar écran, ou microdilution, s'appuient sur des conditions de culture adaptées pour améliorer l'expression de la résistance. Les modifications comprennent l'utilisation de l'oxacilline, incubation à 30 ou 35 ° C plutôt qu'à 37 ° C, et l'ajout de NaCl dans le milieu de croissance. En outre, pour la détection correcte par ces types de techniques, une longue période d'incubation de 24 heures au lieu de 16 à 18 heures est nécessaire. Techniques rapides avec le niveau approprié (> 96%) de la sensibilité pour l'identification de la résistance à la méticilline comprennent des techniques de microdilution automatisés tels que le Vitek carte GPS-SA, le système Rapid ATB Staph, et le système de panneau Microscan rapide qui produisent des résultats après 3-11 h ^9-11. The Crystal MRSA système ID est une méthode rapide basée sur la reconnaissance de la croissance de S. aureus, en présence de 2% de NaCl et 4 mg d'oxacilline par litre avec un détecteur de fluorescence sensible à l'oxygène. Sensibilités réclamés varient entre 91 à 100% après 4 h d'incubation ^12-14. Ces méthodes phénotypiques sont limités dans leurs exactitudes par l'impact des souches prévalentes qui expriment la résistance hétérogène. Par conséquent, les méthodes les plus largement acceptée pour la reconnaissance de la résistance à la méticilline est l'hybridation du gène mecA ¹⁵ PCR ou de l'ADN. Cependant cette technique nécessite l'ADN purifié et est extrêmement sensible à divers adjuvants (impuretés), qui comprennent ¹⁶ débris cellulaires.

En outre, ces techniques ont besoin de temps pour réaliser. Stratégies pour la reconnaissance du produit du gène mecA, la protéine PBP 2a, pourraient être utilisés pour déterminer la résistance et peuvent être plus fiable par rapport aux techniques de test standard ^17.

Il avait été précédemment montré que bactériophage 12600 peut être utilisé comme une sonde de reconnaissance pour les souches de Staphylococcus aureus, y compris ceux ayant une résistance à la méthicilline ^1,2,18. Dans ce travail, nous avons proposé une nouvelle technique dans la détection et l'identification spécifique de SARM, comme la reconnaissance des bactéries avec conformation du SARM en temps réel. A cet effet, un spécifique S. bactériophage aureus avec un large spectre d'hôtes (y compris les souches de SARM) combiné avec un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine (PBP 2a) ont été utilisés. PBP 2a est une protéine de paroi cellulaire et elle est la cause de la résistivité de l'antibiotique SARM. Cependant anticorps 2a PBP n'est pas spécifique à S. aureus depuis quelques autres bactéries ont des protéines de liaison aux antibiotiques avec une similarité de séquence PBP 2a ^19,20. Par conséquent, dans ce travail, S. bactériophage aureus et des anticorps contre la protéine PBP 2a ont été utilisées. Pour être en mesure de développer un biocapteur de spécificationquement détecter et identifier SARM un dispositif à deux temps, a été utilisée. La première étape a utilisé un S. aureus bactériophage monocouche en tant que sonde de détection, tandis que la seconde étape utilise PBP 2a anticorps spécifiques. Par conséquent, la première étape comprendra S. la bactérie Staphylococcus, comme l'autre seront sensibles à la protéine antibiotique contraignant. Lorsque les signaux reçus des deux étapes sont positifs, cela indique la détection spécifique de SARM.

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Protocole

1. Préparer le terrain

1. Obtenir souche de type S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051. Souches résistantes à la méthicilline de S. aureus - MRSA1, le SARM 2, le SARM 5, 13 SARM, le SARM 26, 34 SARM, le SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Le phage lytique 12600.
2. Obtenir PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées.
3. Préparer NZY moyen comme décrit ^21.
4. Procurez-phosphate solution saline tamponnée (PBS).
5. Préparez de l'eau déminéralisée comme sous-phase de Langmuir-Blodgett (LB) de dépôt de la monocouche.

2. Propagation de bactériophages et la titration

1. Incuber 5 ml de culture de nuit de S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10 ⁸ unités formant colonies (UFC) / ml) avec 500 pi de phage (3 x 10 ^{9 <}/ Sup> UFP / ml) dans 500 moyen de NZY ml à 2 L Flack sur agitateur-incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
2. Centrifugeuse culture à 4,424 g pendant 10 min à 4 ° C.
3. Surnageant re-centrifugé à 11.325 g pendant 10 min à 4 ° C.
4. Surnageant filtrer à travers un filtre Millipore 0,22 um.
5. Centrifuger le filtrat à 75 395 g pendant 1,5 heures.
6. Dissoudre le culot dans 100 ul d'eau distillée.
7. Préparer des dilutions de 10 fois de suspension de phages dans le milieu NZY.
8. Plaque 1 ml de culture de la nuit (ON) de S. aureus ATCC 12600 sur chacun des 2 plaques avec de l'agar NZY pour s'assurer que toute la surface est couverte. Enlevez l'excédent de la culture et de laisser sécher la surface pendant 30 min.
9. Détecter un échantillon (10 ul) de la dilution appropriée de phage sur la surface de la plaque et incuber à 37 ^° C pendant 18 à 24 h.
10. Examiner la formation de plaques et de calculer le titre des phages. Les titres bactériophages (T) sont estimés sur la base du nombre de pLaques (N) formé par le volume 10 ul (v) de la suspension de phages et le facteur de dilution (F). Le titre a été calculé par la formule:. T = N / (vxf) Par exemple, pour le nombre de plaques 75 à la dilution 10 ^-7 et le volume de 10 pi (10 x 10 ^-3 ml), le titre est égal 75 / (10 x 10 ^-3 x 10 ^-7) = 7,5 x 10 ¹⁰ unités formant des plages (pfu) par ml de suspension.

3. Phage or immobilisé

1. Morceaux de quartz revêtues d'or propre (60 mm ²⁾ par gravure plasma à l'argon pendant 10 min, puis stériliser pendant 6 heures sous la lumière UV dans une armoire stérile.
2. Ajouter 50 microlitres de 1 x 10 ⁹ PFU / ml suspension de phages à la surface d'or de chaque pièce dans une boîte de Pétri stérile, puis incuber pendant la nuit dans une chambre humide à température ambiante.
3. Retirez et titrer la suspension de phages restant.
4. Lavez morceaux avec phages liés 5 fois avec du PBS pour éliminer non liéephage.

4. Test de Immobilisé infectiosité du phage sur une surface sèche

1. Étaler une culture de la S. Aureus ATCC 12600 O / N sur une plaque de gélose NZY et laisser sécher.
2. Placer une pièce d'or avec des phages immobilisés sur la face de la plaque vers le bas.
3. Respecter une zone de lyse après 12 heures d'incubation à 37 ° C qui indique infectiosité.
4. Utilisez des morceaux couverts d'or sans phage dans des expériences de contrôle.

5. Test de l'activité lytique du phage libre et liée en liquide

1. Ajoutez une culture de S. ON aureus ATCC 12600 à 10 ml de NZY dans tous les 300 ml de quatre flacons arme de poing (6 x 10 ⁶ UFC / ml dans chaque flacon).
2. Ajouter dans deux fioles 2 x 10 ⁶ pfu / ml de phage libre.
3. Utilisez les deux autres ballons comme témoins.
4. Surveiller l'évolution temporelle de S. la lyse des cellules de Staphylococcus à 570 min par la mesure de la densité optique (OD ₆₀₀₎ à intervalles de 30 min pour toutes les fioles.
5. Prendre une mesure finale à 24 h.
6. Répétez les étapes 5.1 à 5.5, mais utiliser des pièces d'or avec des phages liés au lieu de phages libres, et des pièces d'or sans phage dans des flacons de contrôle.

6. Perte de phages liés pendant l'incubation

1. Ajouter 50 pi de 1 x 10 ⁹ PFU / ml phage sur la surface de pièce d'or stérile dans une boîte de Pétri qui est placé dans une chambre humide pendant la nuit à température ambiante.
2. Retirez la suspension de phage non lié à la surface d'or et le titre.
3. Laver la pièce d'or avec phages liés 5 fois avec du PBS et les placer dans une solution à 1 NZY ml dans 15 ml tube dans un shaker-incubateur à 37 ° C pendant 8 heures.
4. Déterminer le titre du phage détaché comme décrit dans 2.

7. Phage Spheroids Préparation

1. La combinaison de 400 pi de stock phage 12600 suspension (10 ¹¹ PFU / ml) avec un volume égal de chloroforme qualité spectrophotométrique dans 1 ml flaconà la température ambiante.
2. Doucement vortex la suspension de phages chloroforme 5-6 fois (intervalles de 5 secondes) sur une durée minute.
3. Laisse la suspension se stabiliser pendant 30 secondes et ensuite la pipette de la phase supérieure contenant sphéroïdes a été prélevée à la pipette pour la préparation de la monocouche.
4. Prendre quelques microlitres de la suspension des sphéroïdes pour la transmission et la microscopie électronique à balayage.
5. Utilisez une suspension sphéroïde restant pour la fabrication de biocapteurs.

8. Préparation biocapteur

1. Nettoyer les capteurs QCM-D par gravure plasma à l'argon pendant 10 min PDC-32G Harrick propre plasma.
2. Rincer capteur avec de l'hexane pour éliminer les impuretés organiques.
3. Préparer et nettoyer une goulotte de l'équilibre du film tel que décrit dans ^22.
4. Remplissez creux LB avec une solution sous-phase et nettoyez-le avec une barrière de creux et de stabiliser le bac à 20 ± 0,1 ° C
5. Étaler 300 aliquote de phage 12600 en suspensi aqueusele (10 ¹¹ PFU / ml) sur subphase LB.
6. Préparer monocouche de phage sur une solution de sous-phase de LB en permettant à 300 aliquote de phage suspension aqueuse 12600 (10 ¹¹ PFU / ml) de descendre une tige de verre mouillable inclinée qui est partiellement immergé dans la sous-phase ^22,23.
7. Stabiliser la monocouche préparé pendant 10 min, et ensuite le comprimer à une vitesse de 30 mm / min (45 cm ² / min), jusqu'à ce qu'une pression constante de 19 N / m est atteinte.
8. Effectuer un dépôt de film sur la verticale positionnée perpendiculairement capteur QCM-D à une vitesse de 4,5 mm / min en trempant successivement capteur dans et hors de la monocouche sept fois. La microscopie électronique de dépôt de monocouches de phages avant l'exposition à des échantillons bactériens ont montré que les couches étaient continu, homogène et uniforme (données non présentées).
9. Répétez les étapes 4,5-4,8 avec une suspension sphéroïde phage qui est préparé en 3.
10. Utilisez biocapteurs de phages fabriqués pour la détection de SARM, d'électronsmicroscopie et ellipsométrie.

9. Test biocapteur, la discrimination de résistant à la méthicilline et bactéries Staphylococcus sensibles

1. Dans ce protocole, les biocapteurs avec phage non modifié et modifié et sphéroïdes de phages sont préparés. Une microbalance à cristal de quartz avec les quatre chambres d'écoulement de capteur est utilisé pour surveiller la liaison de bactéries au phage immobilisé sur la surface du capteur QCM. PBP 2a anticorps billes de latex conjugués sont utilisés pour discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Toutes les mesures sont effectuées en mode de débit (50 l / min) à 5 MHz.
2. Établir une fréquence de résonance de ligne de base du capteur QCM dans l'eau (~ 30 min).
3. Dessiner une suspension de cellules vivantes sensibles à la méthicilline staphylococcus bactériens dans l'eau (10 ⁹ UFC / ml) à travers la cellule d'essai.
4. Continue de surveiller les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation de l'énergie pour la première harmonique, using le logiciel Q-Soft.
5. Lorsque les changements dans la fréquence de résonance des capteurs et de la dissipation atteint des niveaux de saturation, ajouter la suspension de PBP anticorps billes de latex conjuguées (6,77 x10 ¹⁰ billes / ml) à la circulation au cours de la surveillance continue de la fréquence et de la dissipation.
6. Répétez les étapes 9.2-9.5 pour résistant à la méthicilline cellules bactériennes méthicilline (SARM).
7. Définir un changement de fréquence à travers la variation de la masse dues à des bactéries de liaison par l'équation Sauerbrey ^24,25 Af = xn-Δm / C, où C est la sensibilité masse constante (C = 17,7 ng x cm ^-2 x ^-1 Hz à 5 MHz ), m est la masse, et n est le nombre d'harmonique (n = 1).
8. Définir un changement de dissipation d'énergie (Δ D) à partir de l'enregistrement de la décroissance exponentielle de l'oscillation (la fréquence et de l'amplitude d'amortissement, ce qui a permis la quantification de l'énergie dissipée et stockée pendant une période d'oscillation,E _dissipée et E _stocké, respectivement: Δ D = E _dissipée / 2 πE _stocké. Δ D est mesuré en unités de dissipation (UA), l'un = 10 ^-6 unités relatives UA).

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Résultats

Le phage a démontré une activité lytique contre toutes les souches testées de S. aureus, y compris les souches de SARM, comme indiqué par le test de la goutte de phage. tailles de plaque variaient généralement de 5 à 15 mm. Aucune activité n'a été trouvée contre les autres-cultures d'essai (tableau 1).

Une croissance normale de S. aureus ATCC 12600 dans un milieu NZY sur agitateur-incubateur à 37 ° C est représenté en figure ...

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Discussion

Il est bien connu que les phages peuvent être utilisés comme sondes de biocapteurs pour les bactéries pathogènes ^28. Il est démontré dans ce travail que phage avec des anticorps 2a PBP peut être utilisé pour résoudre le vieux problème: les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques discrimination rapides.

Il a été constaté cependant ces phages de staphylocoques non modifiés normales ne sont pas adaptés pour la détection des bactéries avec des dispositifs ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
spectrophotometric-grade chloroform	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Hexane-Anhydrous	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Ethyl Alcohol	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a antibody conjugated latex beads	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan	The MRSA-Screen test
S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600	The culture collection of Auburn University, Auburn, AL
Centrifuge	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB film balance	KSV Chemicals, Finland
Light microscope optical system	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden	E4
Scanning electron microscope (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmitting electron microscopy (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μm, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Gold-coated quartz pieces	Auburn University, AL		Homemade
Petri dishes	Fisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Culture Growing Flasks	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks
Optical Spectrometer	Genesys 20. Thermo Spectronic, USA.	4001
Plasma Cleaner	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Millipore water purification system	Millipore	Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Sweden	QSoft, QTools