Optimierte negative Färbung: ein Hochdurchsatz-Protokoll für die Prüfung kleiner und asymmetrische Proteinstruktur durch Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Mehr als die Hälfte der Proteine ​​sind kleine Proteine ​​(Molekularmasse <200 kDa), die herausfordernd sind sowohl für Elektronenmikroskop Bildgebung und dreidimensionale Rekonstruktionen. Optimierte negative Färbung ist eine robuste und Hochdurchsatz-Protokoll, um einen hohen Kontrast und eine relativ hohe Auflösung (~ 1 nm) Bilder von kleinen asymmetrische Proteine ​​oder Komplexe unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu erhalten.

Zusammenfassung

Strukturbestimmung von Proteinen ist eher eine Herausforderung für Proteine ​​mit Molekülmassen zwischen 40-200 kDa. Bedenkt man, dass mehr als die Hälfte der natürlichen Proteine ​​haben eine Molekülmasse zwischen 40-200 kDa ^1,2, ist eine robuste und Hochdurchsatz-Verfahren mit einer Auflösung im Nanometerfähigkeit benötigt. Negativfärbung (NS) Elektronenmikroskopie (EM) ist eine einfache, schnelle und qualitative Ansatz, der häufig in Forschungslaboratorien verwendet wurde, um die Proteinstruktur und Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Leider herkömmliche NS-Protokolle erzeugen oft strukturelle Artefakte auf Proteine, vor allem mit Lipoproteinen, die in der Regel bilden Geldrollen präsentiert Artefakte. Durch die Verwendung von Bildern von Lipoproteinen aus Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) als Standard wurden die wichtigsten Parameter in NS Probenvorbereitung Bedingungen vor kurzem überprüft und berichtet, wie der optimierten NS-Protokoll (OPNS), einem modifizierten herkömmlichen NS-Protokoll ^3. Artefakte wie rouleaux können stark von OPNS begrenzt werden, zusätzlich bietet hohen Kontrast mit recht hoher Auflösung (in der Nähe von 1 nm) Bilder von kleinen und asymmetrische Proteine. Diese hochauflösenden und kontrastreiche Bilder selbst sind günstig für eine einzelne Protein (ein einzelnes Objekt, kein Durchschnitt) 3D-Rekonstruktion, wie ein 160 kDa-Antikörper, durch die Methode der Elektronentomographie ^4,5. Außerdem kann OPNS ein Hochdurchsatz-Werkzeug, um Hunderte von Proben von kleinen Proteinen zu untersuchen. Beispielsweise die zuvor veröffentlichte Mechanismus 53 kDa Cholesterylester-Transferprotein (CETP) involviert das Screening und die Abbildung von Hunderten von Proben ^6. In Anbetracht Kryo-EM selten erfolgreich Bilder Proteinen weniger als 200 kDa hat bisher noch keine Studie, die das Screening über hundert Probenbedingungen zu veröffentlichen, um fair zu OPNS ein Hochdurchsatz-Verfahren zur Untersuchung kleiner Proteine ​​nennen, ist es. Hoffentlich wird das hier vorgestellte Protokoll OPNS kann ein nützliches Werkzeug, um die Grenzen der E schiebenM und beschleunigen EM-Studien in kleine Protein-Struktur, Dynamik und Mechanismen.

Einleitung

Verständnis der Proteinfunktion erfordert die Kenntnis der Proteinstruktur. Strukturbestimmung ist eine Herausforderung für Proteine, deren Molekülmassen sind innerhalb von 40 bis 200 kDa. Röntgenkristallographie von Proteinkristallisation beschränkt; Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie an Molekülmassen von weniger als 40 kDa beschränkt, während Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat Schwierigkeiten, sowohl die Bildaufnahme und dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von kleinen Proteinen, die Molekulargewichte sind weniger als 200 kDa. Bemerkenswert ist, haben mehr als 50% Proteine ​​ein Molekulargewicht im Bereich von 40 bis 200 kDa ^1,2, wie aktuelle Methoden bei der Untersuchung Proteine ​​dieser Größe eine Herausforderung, ist eine neue Methode benötigt.

Obwohl die meisten Transmissions-Elektronenmikroskope (TEM) sind in der Lage atomarer Auflösung, dh besser als 3 Å Auflösung, erreichen sogar eine in der Nähe von Nanometerauflösung Struktur aus einem biologischen Proben ist eher ChallenGing ^7. Strahlenschäden, geringer Kontrast, Strukturabweichungen sowie Artefakte wie Dehydratation alle behindern hochauflösenden TEM ^3,8.

Unter den verschiedenen Ansätzen TEM ist Kryo-EM eine fortschrittliche und innovative Methode, um Strukturen mit atomarer Auflösung der hochsymmetrischen große Makromoleküle unter physiologischen Bedingungen in der Nähe von ^9-12 zu erreichen. Die Kryo-EM-Probe hergestellt Schockgefrieren der Probenlösung, die Einbettung der Makromoleküle in der glasigen Eis, das anschließend bei Tieftemperaturen, wie flüssigem Stickstoff oder Helium Temperaturen ¹³ abgebildet wird. Kryo-EM hat den Vorteil, dass die Proben keine Artefakte zu präsentieren und sind in ihrer Struktur fast nativen ^8-12. Kryo-EM hat seine Nachteile: i) zusätzliche Geräte erforderlich sind, installiert oder gekauft werden, um eine Standard-TEM-Instrument für eine Kryo-EM-Fähigkeit zu aktualisieren. Geräten gehören: Anti-contaminator, Kryo-Halter, low-dose-Modus Software und Niedrigdosis-Sensitive CCD-Kamera, auch wenn die Preise für diese Geräte sind sehr viel niedriger als der Preis der TEM-Instrument selbst; ii) Kryo-EM-Betrieb braucht mehr Zeit als NS Betrieb. Prüfung eines Kryo-EM-Probe erfordert oft längere Zeit, um Proben vorzubereiten und den Betrieb des TEM Instrument als die der NS weil Kryo-EM müssen zunächst zusätzliche Schwierigkeiten, einschließlich: Temperatur von flüssigem Stickstoff Betrieb, Probenlade, Imaging Drift, Temperaturgradienten, niedrig dosierte Modell Betrieb, Probenstrahlenempfindlichkeit und Dosierung Einschränkungen. Diese zusätzlichen Schritte werden die Geschwindigkeit des Erwerbs von Nutzdaten verglichen mit NS Datenerfassungs verlangsamen, obwohl einige Kryo-EM-Bilder können sicherlich in 1 Stunde oder weniger durch Kryo-EM-Experten mit dem Instrument mit einer ausgewogenen Temperaturgradient hergestellt wurde, erhalten werden; iii) Nutzer Zusatzausbildung, wie Umgang mit Flüssigstickstoff, Einfrieren Kryo-EM-Gitter, niedrig dosierten Betrieb Dosismessung, die Handhabung des Lade, treiben und Wissen in der Bildgebung proc erfordernEssing; iv) fehlende wiederholbare Bildgebung für die gleichen Kryo-TEM-Probe während der verschiedenen Sitzungen. Kryo-EM-Proben werden leicht durch Eis Kontamination während der Proben Be-und Entladen zu / von der TEM-Instrument beschädigt. Dieser Schaden ist vor allem ein Problem, wenn die Proben sind schwer zu isolieren / gereinigten ^14; v) kleine Proteine ​​(<200 kDa Molekülmasse) sind eine Herausforderung, weil der geringe Kontrast abgebildet werden; vi) der niedrige Kontrast und hohe Rausch Kryo-EM-Bilder reduziert die Kreuzkorrelationswert zwischen Bildern, also abnehmende Gesamtgenauigkeit bei der Bestimmung der Protein Ausrichtungen Konformationen und Klassifikationen, insbesondere für Proteine, die strukturell flexibel sind und natürlich schwanken in Lösung ^4,5.

Negative Färbung (NS) ist eine relativ "alte" und historische Methode, die jeder Labor, mit jeder Art EM, nutzen können, um die Proteinstruktur zu untersuchen. Brenner und Horne das Konzept o zuerst entwickeltf negative Färbung vor einem halben Jahrhundert für die Prüfung Viren ^15. NS wird durch die Beschichtung der Probe mit geladenen Schwermetallsalzen durchgeführt. Dieses Konzept stammt ursprünglich aus der Lichtmikroskopie und der Praxis der Einbettung Bakterien in einem Flecken Lösung, die Dunkelheit um die Proben, so dass höhere Bildkontrast bei der Anzeige das negative Bild ¹⁶ kommen. Da die Schwermetallionen haben eine größere Fähigkeit, Elektronen im Vergleich zu weniger dichten Atome in den Proteinen ^17-20 zerstreuen und Schwermetallbeschichtung Fleck erlaubt eine höhere Dosierung Begrenzung mit verbesserten Kontrast. NS Probe kann liefern Bilder mit hohem Kontrast ⁸ für eine einfachere Orientierung Partikelbestimmung und 3D-Rekonstruktion als Bilder von Kryo-EM.

Traditionelle NS, leider kann Artefakte, die durch Fleck-Protein-Interaktionen, wie allgemeine Aggregation, molekulare Dissoziation, Abflachung und Stapel ^8,21,22 induziert produzieren. Für die Lipid-bezogenen ProteIns, wie Lipoproteine ^{​​16,23-30,} eine gemeinsame Artefakt führt zu Partikeln, die gestapelt und verpackt zusammen in einen Geldrollen (Abbildung 1) ^31-36. Viele Studien Lipoprotein, wie nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Kryo-EM-Studien ^13,29,37-40, Massenspektrometrie ^39,41 und Kleinwinkel-Röntgenbeugungsdaten ⁴² zeigen alle Lipoprotein Partikel isolierten Teilchen anstelle von natürlich gestapelt zusammen eine Geldrollen ^{21,29,30,35,42-45} bilden. Die Beobachtung der Geldrollenbildung durch herkömmliche NS wird möglicherweise durch dynamische Wechselwirkungen zwischen Lipoproteine ​​Apolipoproteine ​​(Apo) und Phospholipide, die in Lösung ^{13,29,30,46-49} und Empfindlichkeit der Norm NS-Protokoll strukturell flexibel zusammengesetzt verursacht. Um dieses Artefakt zu identifizieren, wurden Apolipoprotein E4 (ApoE4) Palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) High-Density-Lipoprotein (HDL) Probe als Testprobe und Kryo verwendetEM-Bilder für eine artefaktfreie Standard ^29, das Screening der NS Proben unter einer Reihe von Bedingungen hergestellt. Durch den Vergleich der Partikelgrößen und Formen von NS und Kryo-EM erhalten, wurden die spezifische Art der Färbung Reagenz und Salzkonzentration festgestellt, dass zwei wichtige Parameter verursachen die bekannten Phänomene rouleaux sein. So wurde eine optimierte negative Färbung (OPNS) Protokoll berichtet.

Durch OPNS wurde der bekannte Geldrollenphänomen apoE4 HDL durch OPNS (2A) eliminiert. Die statistische Analyse zeigte OPNS Renditen sehr ähnlichen Bildern (weniger als 5% Abweichung) in Größe und Form im Vergleich zu denen von Kryo-EM, wurde jedoch der Kontrast eliminiert. Die Validierung der OPNS wurden durch Untersuchung der Eliminierung des rouleaux Artefakt fast aller Klassen oder Unterklassen von Lipoproteinen Proben ^{6,29,30,50,51} einschließlich ApoA-I 7,8 nm (Figur 2B), 8,4 nm durchgeführt wird (2C) 9,6 nm discoidal rekonstituierte HDL (rHDL) (2D), 9.3 nm Kugel rHDL (2E), menschliches Plasma-HDL (2F), Lipid kostenlos ApoA-I (2G), Plasma-HDL (2H), Low Density Lipoprotein (LDL ) (2I), Zwischen-Density-Lipoprotein (IDL) (2J), sehr niedrige Dichte Lipoprotein (VLDL) (Abbildung 2 K) und POPC Liposomen (2L) ^{30. 6,29} und hoch flexibel 160 kDa-IgG-Antikörper (4A und B) ^4,5,29 - zusätzliche Validierung durch Abbilden klein und asymmetrische Proteine, einschließlich des 53 kDa-Cholesterylester-Transferprotein (CETP) (C 3A) durchgeführt, ^{, 52,} und zwei strukturell bekannten Proteinen, GroEL und Proteasom (Abbildung 2 M und N). Für jede zusätzliche Validierung von c erfordernolleagues, wir sind offen für alle Blindtests auf dieser OPNS Methode.

OPNS als ein Hochdurchsatz-Methode wurde auch verwendet, um Protein-Mechanismus über die Prüfung Hunderte von Proben von kleinen Proteinen, wie CETP, die auf verschiedene Proteine ​​unter einer Serie Bedingungen (einschließlich CETP in Wechselwirkung zu 4 Klassen von Lipoproteinen, rekombiniert HDL Bindung wurde studieren, Plasma-HDL, LDL und VLDL, mit / ohne 2-Antikörper, H300 und N13, unter 9 Inkubationszeiten, darunter 3 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h und 72 h, unter 4 molaren Verhältnissen, also 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4 und 3 Verdünnungen, dh 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml und 0,001 mg / ml, plus zusätzliche Kontrollproben, einschließlich CETP allein, LDL allein, und VLDL allein, mit Dreifach-Prüfungen der obigen Versuche von verschiedenen Personen) ^6,29. OPNS Bilder von CETP vorgesehen kontrastreiche Bilder mit recht feinen Strukturdetails; ermöglicht es uns, eine 3D-Dichtekarte des 53 kDa sma erfolgreich zu rekonstruierenll Protein CETP (3D - F) durch Einzelpartikelrekonstruktion. Darüber hinaus sind die hohen Kontrast OPNS Bilder geben uns ein ausreichendes Signal von einem einzelnen Protein (4A - C), die uns erlaubt, die Zwischenauflösung (~ 1,5 nm) aus einem einzigen (ein Objekt, kein Durchschnitt) IgG-Antikörper 3D-Struktur zu erreichen über die einzelnen Teilchen Elektronen-Tomographie (IPET)-Methode (4E - J) ^5. Die detaillierte Beschreibung der IPET Wiederaufbaustrategie, Methodik, Schritt-für-Schritt-Prozesse und Strukturvariationsanalyse wurden bereits berichtet ^4. Ein Film über IPET Antikörper Rekonstruktionsverfahren, einschließlich der RAW-Bilder und Zwischenergebnisse, 3D-Dichtekarte und Strukturdocking war auch vorhanden, um Öffentlichkeit zu YouTube hochgeladen ^5. Vergleich der 3D-Rekonstruktionen von verschiedenen individuellen Antikörper Partikel könnten die Proteindynamik und c zeigenonformational Veränderungen bei chemischen Reaktionen ^{von 4,5.}

Bedenkt man, dass über 50% der Proteine ​​haben Molekularmasse im Bereich von 40 bis 200 kDa ^1,2, der Erfolg in Abbildung dieser kleinen Proteinen nachgewiesen, dass OPNS Verfahren ist ein nützliches Werkzeug, um die herkömmliche EM Grenze zu kleinen und asymmetrische Strukturbestimmungen und Mechanismus Entdeckungen drücken . Somit wird die detaillierte Protokoll wie unten angegeben.

Protokoll

1. Herstellung von Frisch Negative Färbelösung bei 1% (w / v)

1. Stellen Sie 1 mg Uranyl Formate (UF)-Pulver in Glasflasche mit 100 ml VE-Wasser in einem dunklen Raum oder Kasten.
2. Rühren Sie die Lösung O / N bei RT in einem dunklen Raum / Box. Wickeln Sie die Lösungsflasche mit Aluminiumfolie, um Licht vom Schlagen der Lösung zu verhindern.
3. Die Lösung wird sanft durch 0,2 um (Porengröße) Filter auf einer 5-ml-Spritze montiert. Die filtrierte Lösung wurde in mehrere Aluminiumfolie abgedeckt Falcon-Röhrchen gesammelt. Der Filter Spritze muss auch mit Aluminiumfolie eingewickelt werden, um Lichtexposition zu vermeiden.
4. Filtern Sie die Lösung wieder durch 0,02 um (Porengröße) Filter auf 1 ml Spritze montiert. Die filtrierte Lösung wurde in 2 ml-Fläschchen gesammelt und aliquote. Die Spritzen und Fläschchen mit Aluminiumfolie vor der Verwendung abgedeckt.
5. Frieren Sie die aliquoten Fläschchen mit langstieligen Zange Eintauchen der Ampullen in flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter sofortNachdem die Lösung wurde filtriert.
6. Übertragen Sie die gefrorene Fläschchen in eine -80 ° C-Gefrierschrank für die Lagerung und die künftige Nutzung.

2. Herstellung der negative Färbung Workstation und Workstation Inkubation

1. Tauwetter ein Fläschchen mit 1% UF-Lösung in einem Wasserbad bei RT gesetzt. Stellen Sie sicher, dass die Aluminiumfolie bleibt rund um die Ampulle eingewickelt, um Lichteinfall zu verhindern.
2. Filtern der Lösung, nachdem es vollständig durch die Verwendung einer Aluminiumfolie 1 ml Spritze mit einer 0,02 um-Filter montiert gewickelt aufgetaut. Sammeln Sie die filtrierte Lösung in eine neue Aluminiumfolie eingewickelt Fläschchen, und stellte es auf dem Eis in einer Kappe abgedeckt Kühlbox warten auf Nutzung.
3. Machen Lösung Platten durch einen Finger schieben ~ 8 Zoll lang Parafilm Folie auf der Oberfläche eines leeren Proteinkristallisationsplatte. Es Reihen von kreisförmigen Platten mit einem Durchmesser von ca. 5 mm zu erzeugen. Machen Sie 6 Platten in jeder Reihe Platz die Parafilm Platten auf einer Fläche von abgeflachten Eis im Inneren eines Eis enthaltenER Deckel, als Färbung Workstation.
4. Pipette ~ 35 ul VE-Wasser auf jede der drei Platten links in jeder Zeile, und Pipetten ~ 35 ul gefiltert UF Lösung auf rechts drei Platten in jeder Zeile. Decken Sie die Färbung einer Workstation mit einem Deckel, um Belichtung vor der Färbung Proteine ​​zu verhindern.
5. Bereiten Sie eine EM-Gitter Inkubationsstation indem ein leeres Feld zur Hälfte mit Eis und neben einem Bügel, der auf einer Trägerbasis angebracht werden kann eingehalten werden. Legen Sie die Probe Pinzette in den Hänger, in dem Tipps der Pinzette "sind in der Nähe der Eisfläche. Hälfte decken die Pinzette "Tipps von der Box Lippenhöhe. Eine ideale Eis-Box, eine Inkubation Station machen wird mit einem leeren Container Pipettenspitzen.

3. OPNS Betrieb

1. Glimmentladung die dünne Kohlenstofffolie beschichtet 300 mesh Kupfer EM-Gitter für 10 Sekunden.
2. Pick-up ein Gitter mit einer Pinzette und haken Sie die Pinzette in den Hänger, indem sie das Netz in einem 45 ° Neigung und 1 Zoll über dem EisOberfläche innerhalb der Inkubation Station.
3. Die Proteinprobe mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DBP) an verdünnten Protein-Endkonzentration von ~ 0,01 ~ 0,005 mg / ml. Anzahlung ~ 4 ul unmittelbar nach der Verdünnung auf den Kohlenstoffseite EM Gitter verdünnten Probe. (DPBS-Puffer können zu einer anderen geändert werden, wenn das Protein empfindlich DPBS)
4. Inkubieren Sie die Probe auf den EM-Gitter für ~ 1 min Inkubation in der Station.
5. Entfernen Sie die überschüssige Lösung durch die Gitterrand mit Filterpapier schnell zu berühren.
6. Berühren Sie das Raster schnell auf die ersten Tropfen (~ 35 ul) der reinen Wasseroberfläche oben auf dem Blatt Parafilm direkt nach der überschüssige Lösung wurde auf der EM Gitter entfernt. Und entfernen Sie dann das überschüssige Wasser sofort mit Filterpapier.
7. Wiederholen Sie Schritt 3.6 für weitere zwei Male durch Waschen des EM Gitter auf den verbleibenden zwei Wassertropfen auf der Parafilm (Schritt 3.6 und 3.7 übersprungen, wenn die Probe sehr empfindlich gegenüber Wasser sein).
8. Schwimmer die EM-grid unmittelbar auf der Oberfläche des ersten Tropfens des UF-Lösung direkt nach dem überschüssiges Wasser auf der EM-Gitter entfernt. Und dann inkubieren für 10 Sekunden. Achten Sie darauf, die Wasserwaschverfahren innerhalb von 3 Sekunden vor schwimm das Gitter auf der Oberfläche der UF-Lösung zu beenden. Je kürzer die Waschzeit, desto besser die Qualität.
9. Reinigen Sie die Pinzette durch Eindringen in die Spitzen in einem Filterpapier für ~ 2 - 3 mal.
10. Entfernen Sie die überschüssige Lösung auf dem Gitter durch Kontakt mit dem Gitterrand mit dem Filterpapier, und dann schweben die Gitter auf dem zweiten Tropfen UF.
11. Weiter oben in Schritt 3.10 auf dem zweiten Tropfen.
12. Float das Gitter auf der dritten Tröpfchen von UF-Lösung und decken die Färbung Station für ~ 1 min.
13. Optionaler Schritt: Waschen Sie das Raster schnell auf eine Oberseite des Wasser wie in 3.6 beschrieben. Dieser zusätzliche Schritt wird Proben, die über geladene Goldpartikel frei oder Flecken Hintergrund profitieren.
14. Entfernen Sie die überschüssige Lösung durch Berühren des Filterpapiers zu the gesamte Raster Rückseite (gegenüber der C-Seite). Trocknen des Gitters unter einem leichten Stickstoffstrom bei Raumtemperatur unmittelbar nach Beobachtung der Absorptionslösung auf das Filterpapier.
15. Legen Sie das Gitter auf ein Blatt Filterpapier in einer Petrischale, und decken Sie die Schüssel teilweise mit einer Kappe, für mindestens 30 Minuten unter RT trocknen. Bei einigen Proben, den Rost in einem 40 ° C Inkubator Backen für eine Stunde.
16. Bewahren Sie das Gitter in einem EM-Gitterkasten für zukünftigen EM untersuchen.

4. EM Prüfungs

1. Richten Sie die TEM richtig vor EM Prüfung der kleine Proteine ​​in der Startaufstellung.
   1. Überprüfen Sie die Auflösung des höchsten sichtbar Thon-Ring, der das Leistungsspektrum aus einer amorphen Kohlenstoffschicht ist, um zu bestimmen, ob die TEM hat richtig ausgerichtet worden. Da die TEM wird von vielen verschiedenen Benutzern geteilt wird, die TEM wurde oft nicht richtig ausgerichtet ist.
   2. Sorgfältig zu prüfen, das Leistungsspektrum auf dem Kohlenstofffilm Fläche der Probe, um die Ausrichtung conditio einstellenn der Maschine. Die höchsten sichtbar Thon-Ringe sind besser als die gezielte Auflösung.
      HINWEIS: Als Beispiel für eine korrekte Ausrichtung eines LaB6 Filament TEM unter 120-kV-Hochspannungs betrieben wird, kann mehr als 20 Thon-Ringe sichtbar gemacht werden, in der, kann die entsprechende Auflösung besser als 5,0 Å. Diese Thon-Ring wurde durch Fourier Transfer eines amorphen Kohlenstofffilms unter einer Defokussierung von ~ 1,6 um und einer Dosis von 20,4 E / A2 (Figur 5) abgebildet erreicht.
      HINWEIS: Die Beobachtung der hohen Auflösung Thon-Ring ist eine notwendige Bedingung, aber keine hinreichende Bedingung für die korrekte Ausrichtung. Um die Bilder mit hoher Auflösung tatsächlich zu erreichen, sind viele andere Parameter auch wichtig, wie Probenqualität, Strahlenschäden, Lade und Driften sowie die Beleuchtung Dosisleistung.
2. Bringen Sie die Unschärfe-zurück in die Nähe-Scherzer-Fokus für die Abbildung der kleine Proteine ​​auf einer ideal verschmutzten Bereich.
3. Suche nach "bewölkt" auf, um die IMAGe. Ein ideal verschmutzten Bereich ist in der Regel in der Nähe der Kante einer dickeren Fleckenfläche, die wie ein "trübe" Bereich auf dem Gitter aussieht, da die Dicke des Flecks in der Regel nicht gleichmäßig auf die mit Kohlenstoff beschichteten Gitter (6) verteilt angeordnet ist. In der Regel eine geringe Vergrößerung (<100x) war, um zu helfen, diese wolkigen Gebieten zu finden, bevor Zoomen für die Bildgebung.

Ergebnisse

Die Implementierungen OPNS umfassen die strukturellen und morphologischen Untersuchungen von verschiedenen Lipoprotein-Arten, wie: entstehenden rekombinanten HDL (rHDL), sphärische rekombinanten HDL, Plasma-HDL, LDL, VLDL und IDL (Figur 2) ^30; sowie kleine Proteine ​​wie 53 kDa CETP (den kleinsten Proteine ​​erfolgreich durch EM abgebildet) (3) ⁶ und 160kDa-IgG-Antikörper (eine der dynamischen und heterogenen Proteine) (Figur 4) ^4,5,29,52 , auch 28 kDa Lipid kostenlos Apolipoprotein A-1 (Abbildung 2 l) und GroEL und Proteasomen (Abbildung 2 M und N).

Andere Beispiele für OPNS als Hochdurchsatzverfahren untersuchen Protein-Protein-Wechselwirkungen für die Aufdeckung der Proteinmechanismen wie 53 kDa CETP. Wie in der Einleitung beschrieben, wie CETP interagiert mit verschiedenen Unterklassen von Lipoproteinen Untersu warenTed über die Prüfung mehr als 400 Exemplare EM ⁶ Soweit wir wissen, gibt es keine solche ein Fall von Kryo-EM-Studie, die Screening beinhaltet fast hundert verschiedenen Bedingungen.

OPNS kann EM Grenzen zu erweitern, um kleine und asymmetrischen Protein 3D-Struktur zu studieren und sogar ausbauen zu erreichen 3D-Struktur und bilden eine einzelne Protein (ohne Mittelung). Beispielsweise IgG Antikörper 160 kDa Molekül mit einer hochflexible Struktur, in der die 3D-Rekonstruktion bei mittleren Auflösung ist eine Herausforderung zu erzielen. die OPNS Verfahren wurde eine einzelne Bild IgG-Antikörper aus einer Reihe von Neigungswinkeln (4E und H) verwendet. Die recht hohe Auflösung und hohen Kontrast Protein Bilder von OPNS für die erfolgreiche Rekonstruktion eines einzelnen Proteins durch einzelne Teilchen Elektronen-Tomographie (IPET) (4E - J) erlaubt ^4,5. In IPET 3D-Rekonstruktion 4 p> 4, die 2D-Neigungs Reihe von gezielten Antikörper wurden nach ihrer berechneten globalen Zentrum über anschließend iterativen Rekonstruktion ausgerichtet, um eine 3D-Dichte bei einer Auflösung von ~ 14,1 Å (4F und G) zu erzielen. Mit der gleichen Methode wurde ein einzelner Antikörper-Peptid-Komplex umgebaut, und das Peptid induzierte die interne Domäne Konformationsänderung eines einzelnen Teilchens Antikörper entdeckt wurde (Abbildung 4E und J, Auflösung ~ 16,6 Å) ^4,5. Vergleich der 3D-Rekonstruktionen aus verschiedenen einzelnen Teilchen kann die Strukturanalyse ermöglicht es uns, Proteinthermodynamischen Schwankungen zeigen, und sogar "Snap-Shot" die Zwischenstufen einer chemischen Reaktion ^{4,5,29,53,54.}

Zusammenfassend sind die Proteine ​​mit Molekülmasse zwischen 40 kDa - 200 kDa Herausforderung für Standard-EM strukturelle Untersuchungen und Rekonstruktionen. Bedenkt man, dass mehr als 50%von Proteinen haben Molekularmasse im Bereich von 40 bis 200 kDa ^1,2 berichten wir einen OPNS Verfahren als robust und Hochdurchsatz-Werkzeug, um die herkömmlichen EM Grenze zu kleinen und asymmetrische Strukturbestimmungen und sogar mechanistische Studien zu schieben.

Abbildung 1. Rouleau Artefakt von Lipoproteinen mit herkömmlichen negative Färbung (NS) EM. Elektronenmikroskopische Aufnahmen (oben Panels) und ausgewählte Partikel (unten Platten) zeigen verschiedene Lipoproteine ​​mit Geldrollen nach NS mit Phosphorwolframsäure (PTA) unter Standard-Mix Verfahren. (A) rekonstituierte HDL (rHDL) mit ApoE4, (B) ApoA-I-enthaltenden 9,6 nm scheibenförmigen rHDL, (C) apoB enthaltenden Plasma-LDL, (D) nicht-Apolipoprotein enthaltenden POPC-Liposomen. Bars: 50 nm auf. Fenstergröße: A und C, 20 nm; B, 30 nm beträgt. Das Journal of Lipid Research veröffentlicht diese Arbeit zunächst ^29,30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Proteinstruktur durch optimierte negative Färbung (OPNS) EM Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen verschiedene Lipoproteine ​​und Liposomen ohne Geldrollen Artefakt OPNS (A) ApoE4-haltigen rHDL;.. (B) 7,8 nm rHDL, (C) 8,4 nm rHDL; ( D) 9,6 nm rHDL, (e) 9,3 nm sphärischen rHDL, (f) Humanes Plasma-HDL-α, (g) Plasma HDL, (H) Humanes Plasma LDL (i) Humanplasma IDL, (J) Humanes Plasma VLDL; (K) POPC Liposomen, (L) Lipid kostenlos ApoA-I. Zusätzliche Überprüfung wurde mit (M) und GroEL (N) Proteasom-Proben durchgeführt. Aufnahmen (oben Panels) und ausgewählte Partikel (unten Panels). Bars: 50 nm auf. Fenstergröße: A - D, 20 nm; E und F, 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J und K, 100 nm; L, 80 nm., Außer Lipid kostenlos ApoA-I, GroEL und Proteasom, Diese Arbeit wurde ursprünglich in der Journal of Lipid Research veröffentlicht ^29,30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. OPNS elektronenmikroskopische Aufnahmen von CETP. (A) Übersicht-Aufnahme mit CETP (gestrichelte Kreise) Bananenförmige Teilchen. (B) windoweD Wählen rohen Teilchen. (C) Drei Einzel roh CETP Partikelbilder deutlich zeigen einen größeren, schwereren und größeren Kugelsternspitze einschließlich der anderen kleiner, leichter und schmaler Spitze (links), Ansicht von oben, die ähnliche terminalen Regionen mit weniger Gesamtkrümmung (Mitte Panel), und am Ende gesehen in der langen Achse von CETP (rechts) (D) Überlagerung der Kristallstruktur (PDB:. 2OBD) auf diesen Ausgangs CETP Partikelbilder, passt gut sowohl strukturelle Form und Domänengröße, welche die Ausrichtung kann fast direkt auch ohne Unterstützung durch den Computer (entsprechend Panels (C)) definiert. (E) Referenz kostenlose 2D-Klasse-Mittelwerte (eine ab-initio-Verfahren, die Ähnlichkeiten (Kreuzkorrelationsberechnung) dieser zufällig orientierten Teilchen zu berechnen, wobei die Partikel eine hohe Ähnlichkeit zueinander gruppiert, ausgerichtet und dann gemittelt, um die Hintergrundgeräusche zu reduzieren und verbessert die Partikel Bild conGegensatz. Die Referenz kostenlose 2D-Klasse Mittelwerte werden durch refine2D.py Software in der EMAN Paket berechnet, in denen, ohne jedes menschliche gemacht ursprüngliche Modell wurde in dieser Klasse durchschnittlich beteiligt. Die Durchschnittswerte der Referenzklasse kann als eigenständige Methode, um die 3D-Rekonstruktion von Einzelpartikel-Rekonstruktion zu validieren) verwendet werden. (F) Ausgewählte Referenz kostenlose 2D-Klasse Mittelwerte zeigen eine größere distale Ende im Vergleich zu den anderen. (G) überlagert Kristallstruktur (PDB : 2OBD) Vergleich zu den Referenz kostenlos Durchschnittswerte, die Overlay-Bilder zeigen eine nahezu perfekte Übereinstimmungen zwischen Kristallstruktur und Referenzfreien Klassendurchschnitt sowohl in Form und Struktur Domänengröße (low-Panel) (F) 3D Dichtekarte CETP bei ein. Auflösung von 13 Å wurde aus 8.879 Partikel durch OPNS und Einzelpartikelrekonstruktionsverfahren (oben) und die geriffelte-Körper in dieser Ein-Teilchen-Rekonstruktion durch die Kristallstruktur (low-Panel) angedockt abgebildet rekonstruiert. Das DETailed Informationen der Einzelpartikel Rekonstruktion, einschließlich Bild-Vorverarbeitung, Ausgangsmodell, Verfeinerung Verfahren, Winkelverteilung und Fourier Shell Correlation (FSC) wurden im Methodenteil veröffentlicht und entsprechende Informationen von der Originalarbeit (H) Schluss Vergleich der Einzelpartikel Rekonstruktion ( über der Tafel) und Zusatz HVE fit Vergleich (unten) ^6. Bars: A, 50 nm; B - D, 10 nm; F, 3 nm. Einige dieser Figuren wurden zuvor in der Nature Chemical Biology veröffentlicht ^6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. OPNS Bilder und Rekonstruktionen von humanen IgG-1-Antikörper-Partikel. (A) überSicht der menschlichen IgG1-Antikörper OPNS Bilder. Partikel in weißen Kreisen dargestellt deutlich die Partikel Display mit 3 Sub-Domains. (B) Ausgewählte hochauflösende RAW-Bilder aus fünf einzelnen unkonjugierten Antikörper Teilchen und (C) ihre entsprechenden rauschreduzierte Bilder durch manuelle Reduzierung von Lärm umgeben Rohspanplatten Kante (ohne Touch jeder Dichte innerhalb der Partikel), leicht zu visualisieren. (D) Die Kristallstruktur (PDB Eintrag 1IGT) der IgG1-Antikörper, der mit einem ähnlich betrachten den EM-Bilder ausgerichtet wurde. Vergleich der entsprechenden Bilder zeigt viele Gemeinsamkeiten zwischen dem Bild und dem EM-Kristallstruktur, einschließlich Domain-Positionen und Formen. (E) Der Schritt-zu-Schritt-Verfahren einer ab-initio-3D-Rekonstruktion von einer einzigen Instanz IgG1-Antikörper (kein Durchschnitt einem einzelnen Objekt) mit Einzelpartikel-Elektronentomographie (IPET) Methode. (F) Die endgültige 3D-Rekonstruktion eines siNGLE Antikörper Partikel bei einer Auflösung von 14,1 Å zeigte drei Donut geformte Domänen bilden in einem "Y" Form. (G) Docking die Domänen Kristallstrukturen in jedes der entsprechenden Domain-Dichte-Karten sind, und unter den Domains manuell Wiederholung der Loops. (H) Der Schritt-zu-Schritt-Verfahren der 3D-Rekonstruktion eines einzelnen IgG-Peptid-Komplex (kein Durchschnitt ein Einzelobjekt) durch IPET. (I) Die endgültige 3D-Rekonstruktion eines IgG-Peptid-Komplex wurde mit einer Auflösung von 16,6 Å angezeigt zeigte drei Stange geformte Domänen bilden in einem "Y"-Form (J) Jeweils Andocken der Kristallstruktur von jeweils IgG Antikörperdomänen (PDB-Eintrag: 1IGT). einander in Stabform Dichten zeigte eine schlecht passende Domain mit Kristallstrukturen, was auf eine innere Domain Konformationsänderung nach Peptid-Konjugation. Die detaillierte Vorgehensweise, Auflösung Analysen und Statistiken wurden in der Originalarbeit beschrieben 5 Bars: A, 50 nm; B - D, 10 nm auf. Diese Arbeit zunächst in PLoS ONE ⁴ veröffentlicht und Scientific Reports ^5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Durch ein Zeiss Libra 120 LaB6 TEM unter 1,6 um-Unschärfe Abbildung 5. Leistungsspektrum der amorphen Kohlenstoffschicht abgebildet. Hochauflösende Bildgebung erfordert ausreichende Beweise, um zu zeigen, dass EM hat die richtige Ausrichtung und hochauflösende Fähigkeit. Die Analyse des Leistungsspektrums der Nähe Kohlen Fläche auf dem Gitter ist eine effiziente Methode, um die Strahlkohärenz Zustand vor der Datenerfassung zu überprüfen. Fourier-Übertragung des Bildes aus einer amorphen Kohlenstoffbereich zeigen die Instrument verbundenen Kontrastübertragungsfunktion (C TF), so genannt, Thon-Ringe. Eine richtige Ausrichtung und Kohärenz kann durch die Anzahl der sichtbaren Thon-Ringe und die höchste Auflösung der sichtbaren Thon Ringe unter einem relativ hohen Unschärfe-Zustand widerspiegeln. / A ^{2 -} als ein Beispiel für eine in der Nähe richtige Ausrichtung Bedingung einer LaB ₆ Filament ausgestattet TEM, mehr als ~ 20 Thon Ringe (~ 5 Å) aus einer Kohlenstoffschicht erzeugt werden sind mit 1,6 um-Unschärfe mit Dosis 20,4 e abgebildet. Thon Ringe aus einem Low-End-TEM erreicht eine ähnlich jener von High-End-TEM, wie eine Feldemissionskanone (FEG) verbesserte TEM unter einer korrekten Ausrichtung Zustand betrieben wird. Diese Arbeit zunächst in Scientific Reports veröffentlicht ^5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Beispiel Aufnahmen von "idealen" Bereiche für OPNS Bildgebung. Drei Proteinproben (A) GroEL (B) Proteasome (C) Kugel HDL wurden als Beispiele verwendet, um die idealen OPNS zur Bildgebung zeigen. Da Flecken ungleichmäßig in der Probe verteilt sind, erscheint die geringe Vergrößerung der Probe in der Regel "bewölkt" (ganz links). Die ideale Bereiche für die Bildgebung werden in der Regel in den Grenzen dieser "Wolken" entfernt. Ein Beispiel von Schritt-für-Schritt-Zoom-in-one "bewölkt" Fleckenregion (links Mitte) zeigen die hohe Vergrößerung Bilder präsentiert mit hochauflösenden und kontrastreiche Bilder von Teilchen (rechts Mitte). Ausgewählte Bilder von Partikeln zeigen die Strukturdetails von Proteinen (ganz rechts). Bars:. 30nm Bitte klicken Sie hier, um eine große zu sehenr-Version dieser Figur.

Abbildung 7: Eine schematische Darstellung OPNS Verfahren. (A) EM Gitter Inkubationsstation, einfach Station, um die Probenlösung auf die Glut-entladen Gitter inkubieren. (B) Färbung Workstation, entworfen, um das Waschen mit Wasser Tröpfchen, Tröpfchen und Fleck über einem Eis Bett zu halten, bei gleichzeitiger Minimierung Fleck Belichtung. (C) Überblick über Färbeverfahren, veranschaulicht: Löschrichtung, 3x mit Wasser gespült, 3x UF Fleck Belichtung Färbung Inkubation mit invertierten Probe Raster Fleck Tropfen und endgültige Rückseite Probe-Blotting, um eine dünne Schicht der Probe Färbelösung vor dem Trocknen durch sicherzustellen Stickstoff Luft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thist Figur.

Abbildung 8. High - auflösende Bilder von 53 kDa kleines Protein CETP ergab, aus einem modifizierten Verfahren OPNS, Kryo-positive-Färbung (Kryo-PS) Fünf wählen hochauflösenden und Kreisform weichen maskierten RAW-Bilder von CETP-Teilchen (mit umgekehrter Kontrast). und Kornform maskiert rohen Teilchen (manuell reduziert Lärm umgibt Rohspanplatten Bilder 'Kanten, aber ohne Änderung der Dichte innerhalb der Partikel), leicht zu visualisieren. All-Atom und Band Kristallstruktur Vergleich zu rohen Teilchen ähnliche Orientierungen der einzelnen Teilchen zu EM-Bilder ausgerichtet maskiert. Die hochauflösenden Details der rohen Bildbereiche anzuzeigen gewisse Ähnlichkeit mit der Kristallstruktur, die zwar nicht alle Funktionen Kristallstruktur kann von Rohdaten behoben werden. Bemerkenswer Bly, diese RAW-Bilder zeigen Ähnlichkeit in beiden terminalen Enden mit kleinen kreisrunden Löchern in der Nähe von Hand reduziert charme Bilder (Dreiecke) zu sehen; Darüber hinaus sind die Stränge in der C-terminalen Regionen innerhalb Partikelbilder ergänzen Kristallstruktur β-Faltblättern (Pfeile) und schließlich vorstehende Schlaufen auf der CETP C-terminalen Region sind ähnlich wie in der Kristallstruktur (Rauten). (A) fünf Auswahl hochauflösenden und Kreisform weichen maskierten RAW-Bilder von CETP-Teilchen (mit umgekehrter Kontrast). (B) Tiefpassfilterung zu 10A. (C) Höhere Tiefpassfilterung zu 20A. (D) Maskierte manuell Lärm verringert Bilder. (E) Kristallstruktur Vergleich durch Bandstruktur. (F) Kristallstruktur Vergleich von allen Atom-Darstellung. Bar: 5 nm. Teil dieser Arbeit wurde in Nature Chemical Biology veröffentlicht ^6.Lank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Liposomen, die Rouleau-Bildung durch herkömmliche NS-Protokoll (PTA-Färbung) bei unterschiedlichen Salzgehalt. (A) Hohe Salzgehalt (~ 0,5 M NaCl). (B) Regelmäßige Salzgehalt (~ 0,25 M NaCl). (C) geringer Salzgehalt (~ 0,1 M NaCl). (D) Reines Wasser. Aufnahmen (oben Tafel) und gezeigt, Fenster Partikel wählen (unten Tafel). Bars: 100 nm auf. Fenstergröße: 80 nm. Das Journal of Lipid Research ursprünglich veröffentlicht diese Arbeit ^30. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Im Vergleich zu herkömmlichen NS Techniken können OPNS rouleaux Artefakte (Abbildung 1 und 9), die zuverlässige und vernünftige hoher Auflösung (~ 1 nm) Strukturdetails von kleinen Proteinen (Abbildung 2) zu verhindern. Verglichen mit Kryo-EM liefert OPNS einen hohen Durchsatz und Verfahren können eine Vielzahl von Proteinen und Protein-Protein-Wechselwirkungen ⁶ zu prüfen. Jedoch hat OPNS noch Nachteile. Im Vergleich zu herkömmlichen NS, OPNS bringt: i) komplizierter Schritte der Probenvorbereitung; ii) unter Verwendung einer radioaktiven Substanz, UF; iii) Halten der Fleck frische aufgrund der kürzeren Potenz des UF-Färbung aufgrund ihrer Lichtempfindlichkeit; iv) zu verhindern Fällung der UF-Lösung muss in -80 ° C gelagert und erfordert Auftauen vor Verwendung; v) und schließlich alle UF sind als gefährlicher Abfall behandelt werden. Im Vergleich zu Kryo-EM, bietet OPNS relativ niedriger aufgelöste Bilder und keine Garantie für jeden noch nicht entdeckt Artefaktin der Zukunft.

NS Betrieb verfahrens Auswirkungen auf Lipoprotein Geldrollenbildung

NS-Protokolle zur Herstellung von Proteinen zur Untersuchung ^16,29-36,55 lassen sich in drei Hauptgruppen von ⁵⁰ Methoden klassifiziert werden: Mischen ^55, Drop-by-Tropfen ¹⁶ und ²⁹ Waschverfahren. i) Die Mischprotokoll erfordert die vorherige Vermischung des Flecks und die Proteinprobe in einem spezifischen Verhältnis, und dann die gemischte Lösung auf Kohlenstofffilm auf einem Raster beschichtet schließlich Entfernen der überschüssigen Lösung mit Filterpapier vor der Lufttrocknung für EM Prüfung ^55. ii) Der Tropfen für Tropfen-Protokoll beinhaltet die Anwendung (~ 4 ul) Probentropfen direkt an einer EM-Gitter in Carbon lassen sit für ~ 1 min beschichtet, anschließend Entfernen von überschüssigem Probenlösung vor der Anwendung von einem Tropfen (~ 4 ul) von Flecken Lösung auf der gleichen Seite des Gitters. Nach ca. 1 min Inkubation, entfernen Sie die excess Fleck durch den Kontakt mit sauberem Filterpapier, schließlich die Vorlage für Lufttrocknung ^16,56-58. iii) Das Waschprotokoll (7) erfordern Probenlösung Anwendung auf eine EM-Gitter in C für 1 min beschichtet, dann Waschen mit entionisiertem Wasser dreimal direkt nach Entfernen der überschüssigen Lösung jeweils durch Filterpapier ^3,29,30. OPNS Protokoll wurde von diesem Waschverfahren modifiziert.

NS Fleckenarten und Auswirkungen auf die Lipoprotein-Geldrollenbildung

In NS, stärkere Elektronenstreuung durch Schwermetall Flecken bieten dagegen von den Proteinen ^17-20,59. NS Proben können zusätzlich leiden höhere Strahlendosen und verbessern Proteinfunktionen durch eine schärfere negative Kontrast ^8,9,60. Flecken von Schwermetallen können wie folgt eingestuft werden: anionische, einschließlich Phosphorwolframsäure (PTA) ^{16, 14} und Methylamin-Wolframat Siliziumwolframat ^61; und Kationenic, wie Uranylacetat (UA) ^62, UF ^3,29,30 und Uranylnitrat (UN) ^63. Eine der anionischen NS Flecken, die am häufigsten verwendet wird, ist PTA ^33,64-67. PTA ist eine Heteropolysäure, die typischerweise um einen pH von 7,0 verwendet wird, - 7.5. PTA kann auch für eine positive Färbung ^3,16,68 verwendet werden. Die negativen Ladungen der PTA können elektrostatische Wechselwirkungen mit ungesättigten Lipiden Kopfgruppen positiv geladen, wie POPC, auf beiden Lipoprotein und Liposom-Oberflächen vermitteln. PTA können Geldrollenbildung durch diese Interaktion auch unter ^29,30 regelmäßige Puffersalzgehalt ^29,30 (Abbildung 1) führen. Uranyl Flecken, wie UA, UF und UN alternative Auswahl für kationische Schwermetalle Flecken und UA insbesondere häufig für NS einer Vielzahl von biologischen Proben ^62,69,70 verwendet. Experimente gefunden UF verursacht keine Geldrollen von Lipoproteinen, die ungesättigte Fettsäure Lipide wie POPC enthalten. Allerdings kann immer noch UF roule induzierenaux Bildung an Lipoprotein, das gesättigte Fettsäure Lipide, wie Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und 1-Hexadecanoyl-2-Octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (PSPC) enthalten. Der detaillierte Mechanismus dieser Wechselwirkung ist nicht bekannt. UA / UF / UN können alle Arbeiten bei niedrigeren pH-Werten von 3,5 bis 4.6. Wie niedrigere pH-Werte möglicherweise nicht für bestimmte biologische Makromoleküle, die empfindlich auf pH-Wert ^14,71 sind. Interessanterweise kann UA / UF Proteinstruktur innerhalb weniger Millisekunden durch einen unbekannten Mechanismus ⁷² zu fixieren. Anders als PTA, ist UA / UF mehr ähnlich einem Salz als einer Säure.

UF kann angeblich bessere Ergebnisse liefern als UA ^73, in welchem, haben UF und UN-Flecken kleineren Korngrößen als UA (UF: 0,3 nm, UN: ~ 0,5 nm) ^3,74. Ein interessantes Beispiel, wie Sekundärstruktur-Details einer kleinen Protein (53 kDa CETP) können direkt aus den rohen mikroskopischen Aufnahmen sichtbar gemacht werden, wenn UF wurde als Negativ-Fleck-Reagenz verwendet, indem Sie diefrüher berichtet Kryo-Positiv-Färbung (Kryo-PS)-Methode (Figur 8) ^6. In Kryo-PS, die gefärbte Probe wurde der Flash durch folgende Kryo-EM Probenvorbereitung statt Trocknungsverfahren in OPNS-Protokoll, das die sekundären Struktur Zusammenbruch führen können eingefroren. Die Kryo-PS ist eine Methode für kontrast und hochauflösende Bildgebung von kleinen Proteinen ^75. Da die Kryo-PS Bilder sind dagegen umgekehrt im Vergleich zu denen aus dem ausgewiesenen Kryo-NS-Protokoll ^22, haben aber eine konsistente Bild Gegensatz zu denen von herkömmlichen Kryo-EM-Bilder, damit es benannt wurde die Kryo-PS-Methode. Die Kryo-PS-Bilder zeigen, dass die Färbereagenz, Uranyl Formiat, dringt in die Moleküloberfläche, gegen die herkömmliche Ansicht, dass Färbung kann nur die äußere Oberflächenstruktur sichtbar zu machen. Der Mechanismus, wie Uranyl Formiat dringt in die Moleküloberfläche ist unbekannt. Eine Möglichkeit ist, dass die Uranylkation bindet erhältlichen Protein Carboxylgruppen und damit dieumgebenden glasigen Eis eine geringere Dichte als die Färbung der Proteine ​​und Uranyl-Gruppen, wodurch eine positive Fleck wirkt. Die Kryo-PS-Methode ist ähnlich wie mehrere isomorphen Ersatzes (MIR)-Methode, die einen gemeinsamen Ansatz für die Phasenproblem in der Röntgenkristallographie ^76-78 zu lösen war. In MIR werden Kristallproben mit einem Schweratom-Lösung, einschließlich Uran eingeweicht, um eine isomorphe Form seiner nativen Form zu erhalten. Die Zugabe der Schweratom manchmal keinen Einfluss auf die Kristallbildung oder Elementarzelle Dimensionen, sondern bietet zusätzliche Informationen von Kristallstrukturbestimmung ^76-78. Durch die Nutzung der kleinen Körnchen UF, könnte Kryo-PS einen hohen Kontrast und hochauflösendes Bild von einem einzigen Protein, das wichtig für die Proteinstrukturuntersuchungen ist, vor allem wenn man bedenkt, dass fast alle Proteine ​​sind natürlich dynamische und heterogene Lösung. Zur Validierung dieser Kryo-PS-Methode, öffnen wir für jede Blindtest aus dem EM-Feld.

Salzkonzentration Auswirkungen auf die Geldrollenbildung in Lipoproteinen

Mit traditionellen PTA negative Färbung Reagenz wird beobachtet Geldrollenbildung eher Lipid-Wechselwirkungen statt Protein-Wechselwirkung stehen. Abbildung der Proben von POPC Liposomvesikel unter erheblichen Salzgehalt (0,5 M NaCl), moderate Salzgehalt (0,25 M NaCl), relativ schwache Salzgehalt (0,1 M NaCl) und reines Wasser (Abbildung 9) vorbereitet, die elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, die Geldrollenbildung war Salzkonzentration (- D 9A) korreliert. Verwendung UF als negative Färbung Reagenz wurde kein Geldrollen in POPC Liposom-Vesikel-Probe ³⁰ (2 l) beobachtet, was den Waschvorgang, um die Salzkonzentration rechts vor der Färbung ist ein Bedarf schnell zu reduzieren, aber nicht unabhängig ausreichende Schritt zur Verhinderung einer Geldrollen in POPC verwandten Proben.

TEM kleines Protein erfordert eine nahezu Scherzer-Fokus Zustand.

Erfolgreiche TEM-Aufnahmen von kleinen Proteinen mit höherer Auflösung benötigt zwei kritischen Bedingungen, eine richtige Strahlausrichtung und eine nahezu Scherzer-Fokus Erwerb Zustand. i) Eine geeignete Strahlausrichtung kann durch die Anzahl der sichtbaren Thon Ringe (Leistungsspektrum) auf der Fourier Transfer eines Kohlenfilmbild unter einem relativ hohen Defokussierungsbetrag erfasst beurteilt werden. Je besser der Zustand Ausrichtung des Strahls, desto mehr Thon Ringe visualisiert werden und messbare .. ii) Der Erwerb Bild unter einem Beinahe-Scherzer-Fokus ist ein weiterer kritischer Zustand. Eine traditionelle Standardstrategie zur Abbildung biologischer Proben verwendet typischerweise hohe Unschärfe-(1 - 2 um und noch mehr), die die biologische Probe Bildkontrast ⁷⁹ verbessern können. Diese Strategie ist signifikant anders als die typischen Strategie zur Abbildung atomarer Auflösung Struktur aus harten Materialien, die oftnutzt eine in der Nähe von Scherzer-Fokus (~ 50 nm Defokussierung). Obwohl, könnte eine höhere Unschärfe-biologischen Probe Gegensatz zu stärken, wäre hochauflösende Signale teilweise beseitigt werden. Als Ergebnis würde die Komplizenschaft hochauflösende Signal niedriger bei einem höheren Unschärfe-Imaging-Zustand sein. Der Grund dafür ist, dass das TEM-Bild ist die Faltung der Probenstruktur und das Instrument CTF. Die CTF ist eine Schwingkurve gegen die Frequenz, bei der die Kurve häufig oszilliert Kreuzung Null-Amplitude mit hoher Frequenz. Jedes Mal, wenn CTF über Null, wird die Probe Struktursignal an dieser bestimmten Frequenz beseitigt werden (null mal beliebige Zahl Null sein). Das eliminiert Signal bei dieser Frequenz kann von keinem CTF Korrekturalgorithmus (a Null dividiert durch eine Null kann jeder Zufallszahl anstelle der ursprünglichen Struktur Signal) gewonnen werden. Bei höheren Defokussierung Bildgebung wird die CTF oszillieren viel aggressiver, durchquert daher die CTF Amplitude Null häufiger als Ergebnis,die Struktursignalen mit einer größeren Anzahl von spezifischen Frequenzen eliminiert. Je mehr Signale, die beseitigt werden, desto weniger wird das Bild Mitschuld haben. Bemerkenswert ist, kann die Mitschuld der Bild nicht wiederhergestellt oder durch eine CTF-Korrektur korrigiert werden. Jedoch kann eine Anzahl von unter verschiedenen defokussiert erworben incompleted Bilder verwendet werden, um ihre Abstände über eine Mittelungsverfahren, bei dem auch eine atomare Auflösung erreicht ^9-12 werden miteinander zu einem fertigen erhaltenen Struktursignal der Probenstruktur zu füllen.

Die Mittelungsverfahren ist ein leistungsfähiges Konzept, das die Struktur einiger hochsymmetrischen Proteine ​​und strukturell verwandte Proteine ​​starren erreichen. Allerdings bleibt es schwierig in der strukturellen Untersuchung kleiner und asymmetrische Proteine, insbesondere für die Strukturdynamik und flexible Proteine, wie Antikörper und HDL. Mittelung auf der Annahme, dass die Proteinpartikel in der Struktur und Konformation aber di identisch basierendfferent in Orientierungen jedoch viele Proteine ​​sind dafür bekannt, thermodynamischen Fluktuation in Lösung unterzogen werden. Durch die Anwendung der Durchschnittsmethode ohne vorher zu wissen, die Protein-thermodynamische Fluktuation Schwankungen kann die gemittelte Struktur verursachen oft fehlt Domänen ^10,80 oder lokale Variation in der Auflösung ⁸¹ in Kryo-EM-Rekonstruktionen.

Der Erfolg bei der Erreichung der 3D-Rekonstruktion von kleinen Protein wie 53 kDa CETP und 3D-Struktur eines einzelnen Proteins, wie beispielsweise 160 kDa IgG1-Antikörper, Vorteile aus der Verwendung der in der Nähe von Scherzer-Fokus-Bilderzeugungsbedingung unter einer korrekten Ausrichtung erhalten. Obwohl der Bildkontrast niedrig erscheint in der Nähe von Scherzer-Fokus Bildern kann der Kontrast durch einfaches Anwenden eines Tiefpassfilterung, um das hochfrequente Rauschen im Hintergrund zu reduzieren verbessert werden. Wir glauben, die in der Nähe von Scherzer-Fokus Bilder tragen die maximale strukturelle Signale und kann die Genauigkeit der Partikelausrichtung zu erhöhen und effizienz in Einzelpartikel-3D-Rekonstruktion und Einzelpartikelelektronentomographie Wiederaufbau.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stain: Uranyl Formate	The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.	02545-AA	http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Syringe: 1 ml NORM-JECT	VWR	89174-491	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Syringe filter: 0.2 μm	VWR	28145-487	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-Aldrich	D8537	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US
Parafilm: 4 in. x 125 ft.	VWR	470152-246	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh	EMS (Electro Microscopy Sciences)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Tweezer: Dumont Tweezer L5	EMS (Electro Microscopy Sciences)	72882-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System	EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10	http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filter Paper: Grade 1 circles	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Aluminum Foil			Any type
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[header]
Glow Discharge Unit	Ted Pella	91000	http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors	VWR	89174-524	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet	Pipetman	F161201 and F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx