Оптимизированная Отрицательный Окрашивание: Высокая пропускная протокол за рассмотрение Малый и Asymmetric Protein Structure по электронной микроскопии

Резюме

Более половины белков небольшие белки (молекулярная масса <200 кДа), которые являются сложными как для электронного микроскопа изображений и трехмерных реконструкций. Оптимизированная отрицательное окрашивание это протокол надежной и высокой пропускной получить высокую контрастность и относительно высокое разрешение (~ 1 нм) образы малых асимметричных белков или комплексов при различных физиологических условиях.

Аннотация

Структурное определение белков, а вызов для белков с молекулярными массами от 40 - 200 кДа. Учитывая, что более половины природных белков имеют молекулярную массу между 40 - 200 кДа ^1,2, надежный и высокой пропускной метод с разрешающей способностью нанометрового необходимо. Отрицательный окрашивание (NS) электронная микроскопия (ЭМ) является простым, быстрым и качественный подход, который часто используется в научно-исследовательских лабораториях для изучения структуры белков и белок-белковых взаимодействий. К сожалению, обычные NS протоколы часто генерируют структурные артефакты на белки, особенно с липопротеинов, что, как правило, формируют представления ROULEAUX артефакты. Используя образы липопротеинов из крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) в качестве стандарта, ключевые параметры в NS условий приготовления образца были недавно был показан и сообщил, как оптимизированного протокола NS (маркировок), модифицированной традиционной протокола NS ^3. Артефакты, как роuleaux может быть значительно ограничен маркировок, дополнительно обеспечивая высокую контрастность наряду с разумно высоким разрешением (около 1 нм) образы малых и асимметричных белков. Эти высоким разрешением и высокой контрастностью изображения даже благоприятным для отдельного белка (единый объект, не средняя) 3D реконструкции, например кДа антитела 160, с помощью метода электронного томографии ^4,5. Кроме того, маркировок может быть высокой пропускной инструментом для изучения сотен образцов малых белков. Например, ранее опубликованные механизм 53 кДа белка-переносчика эфиров холестерина (CETP) включает скрининг и визуализации сотен образцов ^6. Учитывая крио-ЭМ редко успешно изображения белки менее 200 кДа до сих пор не публиковать любую исследование с участием скрининга более ста условия выборки, это справедливо для вызова метода высокой пропускной для изучения малых белков маркировок. Надеюсь протокол маркировок, представленные здесь может быть полезным инструментом для раздвинуть границы ЕМ и ускорить исследования EM на мелкие структуры белка, динамики и механизмов.

Введение

Понимание функции белка требует знания структуры белка. Структурное определение является сложной задачей для белков, молекулярная массы в пределах 40 - 200 кДа. Рентгеновской кристаллографии ограничено кристаллизации белка; ядерного магнитного резонанса (ЯМР) ограничивается молекулярными массами менее 40 кДа, в то время как крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) испытывает трудности в обоих получения изображений и трехмерных (3D) реконструкций небольших белков, которые молекулярные массы являются менее чем 200 кДа. Следует отметить, что более 50% белки имеют молекулярную массу в пределах от 40 - 200 кДа ^1,2, а в настоящее время методы являются сложными в изучении белков такого размера, новый метод не требуется.

Хотя большинство просвечивающей электронной микроскопы (TEMS) способны атомным разрешением, то есть, лучше, чем 3 резолюции А, достижения даже вблизи структуру нанометровым разрешением от биологического образцов довольно ChallenГинг ^7. Радиационные повреждения, низкая контрастность, структурные отклонения а также артефакты, такие как обезвоживание все препятствовать высоким разрешением ТЕМ изображений ^3,8.

Среди различных подходов ТЕМ, крио-ЭМ является передовым и резки метод край для достижения атомные структуры разрешением высокой симметричных крупных макромолекул в условиях, близких физиологических условиях ^9-12. Образец крио-ЭМ получают вспышку замораживание раствора образца, встраивания макромолекул в стекловидного льда, который затем отображаемого при криогенных температурах, таких как жидкий азот или гелий температурах ^13. Cryo-EM выгодно тем, что образцы не представляют артефакты и почти родной в структуре ^8-12. Cryo-EM имеет свои недостатки: я) дополнительные устройства, необходимые для установки или приобрести обновить стандартный ТЕМ инструмент для возможности крио-ЭМ. Устройства включают в себя: анти-загрязнитель, крио-держатель, режим программного обеспечения низкой дозы и низкой дозы Sensiный ПЗС-камера, хотя цены этих устройств значительно ниже, чем стоимость самого инструмента ТЕА; II) операция крио-ЭМ нужно больше времени, чем операции NS. Исследование образца крио-ЭМ часто требуется больше времени, чтобы подготовиться образцы и работать ТЕА инструмент, чем у NS потому крио-ЭМ требует решения дополнительных трудностей, в том числе: жидкого работы температуры азота, образца зарядки, дрейфа изображений, температурных градиентов, низких доз Модель функционирования, чувствительность излучения образца и ограничения лекарственные. Эти дополнительные шаги будут замедлять скорость приобретения полезных данных по сравнению с приобретением данных NS, хотя несколько изображений крио-ЭМ, безусловно, может быть получена в 1 ч или менее эксперты крио-ЭМ с прибором, подготовленного со сбалансированной градиента температуры; III) пользователи нуждаются в дополнительной подготовке, например, обработки жидкого азота, замораживание крио-ЭМ решеток, рабочих низкой дозы, измерение дозы, обработки зарядку, дрейфующих и знания в визуализации прокэссинга; IV) отсутствие повторяемости изображений для тех же крио-образца во время различных сессий ТЕМ. Крио-EM образцы быстро выходят из строя в результате загрязнения льда во время образца погрузки и разгрузки к / от инструмента ПЭМ. Это повреждение особенно проблемой, когда образцы трудно быть выделено / очищено ^14; V) маленькие белки (<200 кДа молекулярная масса) являются сложными для включения в образ из низкой контрастностью; VI) с низким и высоким контрастом шум крио-ЭМ изображений уменьшает значение взаимной корреляции между изображениями, таким образом, уменьшая общую точность при определении белковых ориентаций, конформации и классификаций, особенно для протеины, которые структурно гибким и, естественно, колеблются в растворе ^4,5.

Отрицательный окрашивание (NS) является относительно «древний» и исторический метод, который любой лаборатории, с любым типом EM, могут использовать для изучения структуры белка. Бреннер и Хорн впервые разработал концепт Oе отрицательное окрашивание полвека назад для изучения вирусов ^15. NS осуществляется через покрытие образца с заряженными солями тяжелых металлов. Эта концепция изначально идет от световой микроскопии и практике внедрения бактерий в пятно решение, обеспечивающее тьму вокруг образцов, что позволяет более высокую контрастность изображения при просмотре негативный образ ^16. Так как ионы тяжелых металлов имеют большую способность для разгона электронов по сравнению с менее плотными атомов в белках ^17-20, и покрытие тяжелых металлов пятно позволяет более высокой дозировке ограничение с улучшенной контрастностью. NS образец может обеспечить высокую контрастность изображения ⁸ для облегчения определения ориентации частиц и 3D реконструкции, чем изображения с крио-ЭМ.

Традиционные NS, к сожалению, может производить артефакты, вызванные пятно-белковых взаимодействий, таких как генеральной совокупности, диссоциации молекул, сплющивание и укладки ^8,21,22. Для окисления липидов, связанных с защмодули, такие как липопротеины ^16,23-30, общий артефакт приводит частиц, которые укладываются и упакованные вместе в ROULEAUX (Рисунок 1) ^31-36. Многие исследования липопротеинов, такие как нативных полиакриламидном градиентного гель-электрофореза, крио-ЭМ изучает ^13,29,37-40, масс-спектрометрии ^39,41 и малый угол дифракции рентгеновских лучей данных ⁴² все частицы липопротеинов показывают единичные частицы, естественно, вместо сложены вместе, образуя ROULEAUX ^{21,29,30,35,42-45.} Наблюдение образования монетных столбиков с помощью обычных NS, возможно, вызваны динамических взаимодействий между липопротеинами, состоящих из аполипопротеинов (APO) и фосфолипидов, которые структурно гибким в растворе и чувствительностью ^{13,29,30,46-49} со стандартным протоколом NS. Чтобы определить этот артефакт, аполипопротеина E4 (apoE4) пальмитоил-oleoylphosphatidylcholine (POPC) липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) образец были использованы в качестве опытного образца и криоЭм изображения артефакта бесплатно стандарта ²⁹ скрининга образцов NS подготовленные в рамках ряда условий. При сравнении размеров и формы частиц, полученных из NS и крио-ЭМ, конкретный тип окрашивающего реагента и концентрации соли Было обнаружено, что две ключевые параметры, вызывающие хорошо известные ROULEAUX явления. Таким образом, было сообщено оптимизирован отрицательное окрашивание (маркировок) протокол.

По маркировок, известно ROULEAUX явление ApoE4 HDL был ликвидирован маркировок (рисунок 2А). Статистический анализ показал, маркировок урожаи очень похожие изображения (менее 5% отклонения) в размере и форме по сравнению с теми, от крио-ЭМ, однако контраст был ликвидирован. В валидации из маркировок проводились путем изучения ликвидацию монетных столбиков артефакта почти всех классов или подклассов образцов липопротеинов ^{6,29,30,50,51,} в том числе апоА-I 7,8 нм (Рисунок 2B), 8,4 нм (рис 2С) , 9,6 нм гiscoidal воссоздана HDL (рЛВП) (Рисунок 2D), 9,3 нм сферической рЛВП (Рисунок 2E), человеческой плазме ЛПВП (Рисунок 2F), липидов бесплатно апоА-I (Рисунок 2G), плазменный HDL (Рисунок 2H), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП ) (Рисунок 2I), средней плотности липопротеинов (IDL) (Рисунок 2J), очень низкой плотности липопротеинов (ЛПОНП) (Рисунок 2K), и POPC липосомы (Рисунок 2 л) ^30. Дополнительные валидации были выполнены визуализации малых и асимметричные белки, в том числе 53 кДа белок передачи эфиров холестерина (CETP) (Рисунок 3A - C) ^6,29, и очень гибкий 160 кДа IgG антитела (рисунок 4А и В) ^{4,5,29 , 52,} и два структурно известные белки, GroEL и протеасомы (рисунок 2 М и N). Для требуя дополнительной проверки от сolleagues, мы открыты для любых слепых тестах на этом методе маркировок.

Маркировок, как это протокол с высокой пропускной также используется для изучения механизма белка с помощью изучения сотен образцов малых белков, таких как СЕТР, который был связывания с различными белками в соответствии с условиями серии (в том числе СЕТР взаимодействующих с 4 классами липопротеинов, ЛПВП рекомбинации, плазмы ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП, с / без 2 антител, H300 и N13, по времени 9 инкубации, в том числе 3 мин, 20 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 24 часов, 48 часов и 72 часов, 4 под молярные отношения, то есть 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, 3 и разведения, т.е. 0,1 мг / мл, 0,01 мг / мл и 0,001 мг / мл, плюс дополнительные контрольные образцы, в том числе одна СЕТР, одна ЛПНП, и ЛПОНП в одиночку, с тройным испытаний выше экспериментов разными лицами) ^6,29. Маркировок образы ПООППО условии высокую контрастность изображения с достаточно мелкими деталями строения; позволяет нам успешно реконструировать 3D карту плотности 53 кДа SMALL белок СЕТР (Рисунок 3D - F) по реконструкции одного частиц. Кроме того, высокая контрастность маркировок изображения обеспечивают нам достаточное сигнал от отдельного белка (Рисунок 4А - C), что позволило нам добиться промежуточного разрешение (~ 1.5 нм) из одного (одного объекта, не средняя) IgG антитела 3D структуру с помощью метода (Рисунок 4E - J) индивидуально-частиц электронной томографии (МПГЭ) ^5. Подробное описание МПГЭ стратегии реконструкции, методологии, шаг за шагом процессов и анализа структурно вариации были ранее сообщалось ^4. Фильм о процедурах восстановления МПГЭ антител, в том числе необработанных изображений и промежуточных результатов, карте плотности 3D и структурной стыковки была также доступна для общественности по загружены на YouTube ^5. Сравнение 3D реконструкции из разных индивидуальных антител частиц может выявить динамику белков и Сonformational изменения во время химических реакций ^4,5.

Учитывая, что более 50% белков имеют молекулярную массу в пределах от 40 - 200 кДа ^1,2, успех в визуализации эти маленькие белки свидетельствует, что метод маркировок является полезным инструментом, чтобы подтолкнуть условную границу EM к малым и асимметричных структурных определений и открытий механизма . Таким образом, Подробный протокол обеспечивается, как показано ниже.

протокол

1 Получение Свежий отрицательного окрашивающим раствором в количестве 1% (вес / объем)

1. Положите 1 мг уранила формиат (UF) порошок в стеклянной бутылке, содержащей 100 мл деионизированной воды в темной комнате или коробке.
2. Раствор перемешивают O / N в РТ в темной комнате / коробке. Оберните бутылку решение с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить свет от удара решение.
3. Фильтр раствор осторожно через 0,2 мкм (размер пор) фильтр, установленный на 5 мл шприца. Отфильтрованный раствор собирали в нескольких из алюминиевой фольги, покрытых пробирки Фалкон. Фильтр шприц также должны быть обернуты алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить попадания света.
4. Фильтр решение снова через 0,02 мкм (размер пор) фильтра, установленного на 1 мл шприц. Отфильтрованный раствор собирали и аликвоты по 2 мл в ампулах. В шприцы и флаконы прикрываясь алюминиевой фольги перед использованием.
5. Немедленно заморозить аликвоту флаконов, используя длинной ручкой пинцета погрузив флаконов в жидком азоте заполнено контейнерепосле того, как раствор фильтруют.
6. Перенесите замороженных флаконов в -80 ° C морозильник для хранения и дальнейшего использования.

2 Получение отрицательного окрашивания Workstation и инкубации Workstation

1. Оттепель флакон 1% раствора UF на водяной бане при комнатной температуре. Убедитесь, что алюминиевая фольга остается обернуты вокруг флакона с целью предотвращения воздействия света.
2. Фильтр решение после его полностью оттаять с помощью алюминиевой фольги завернутые 1 мл шприц, установленный с фильтром 0,02 мкм. Соберите отфильтрованный раствор в новой алюминиевой фольги, обернутой флакон, и положил его на льду внутри крышки покрыты ледовой коробке ждет использования.
3. Сделайте раствор пластины пальцем, нажав ~ 8 дюймовый долго парафильмом лист на поверхность пустой кристаллизации белка пластины. Он будет генерировать ряда круглых пластин диаметром ~ 5 мм. Сделайте 6 пластин в каждом ряду место парафильмом плиты на поверхности уплощенной льда внутри льда содержатьэ крышка, в качестве рабочей станции окрашивания.
4. Пипеток ~ 35 мкл деионизированной воды на каждый из оставшихся трех пластин в каждой строке, и пипеток ~ 35 мкл отфильтрованного раствора UF на правой трех пластин в каждой строке. Накройте рабочую станцию ​​окрашивания с крышкой для предотвращения попадания света перед окрашиванием белков.
5. Подготовка EM сетки инкубации станции путем заполнения наполовину пустой коробки со льдом, и выдерживать рядом с вешалкой, которые могут быть установлены на опорном основании. Поместите образец пинцетом в вешалке, в которой советы пинцет »находятся неподалеку поверхность льда. Половина покрытия советы пинцет »от высоты коробки губ. Идеальный коробка льда, чтобы сделать инкубационный станции использует пустую советы Внесите контейнер.

3 маркировок Эксплуатация

1. Тлеющего разряда тонкая углеродная пленка с покрытием 300 сетки меди EM сеток в течение 10 сек.
2. Возьмите сетку с помощью пинцета и крючком пинцетом в вешалку, сохраняя сетку на дюйм 45 ° наклона и 1 выше льдуПоверхность внутри инкубационного станции.
3. Развести образца белка с Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (ППД) в конечной концентрации белка ~ 0,01 до ~ 0,005 мг / мл. Депозит ~ 4 мкл разбавленного образца сразу же после разбавления по углерода стороне EM сетки. (DPBS могут быть изменены в другой буфер, если белок чувствителен к DPBS)
4. Выдержите образец на сетках ЭМ для ~ 1 мин внутри инкубационного станции.
5. Удалить избыток раствора через быстро касаясь сетки край с фильтровальной бумагой.
6. Нажмите на сетку быстро первой капли (~ 35 мкл) чистого поверхности воды поверх листа Parafilm сразу после того, как избыток раствора удаляют на EM сетки. А потом удалить лишнюю воду быстро фильтровальной бумагой.
7. Повторите шаг 3,6 в течение еще два раза путем промывки сетки ЭМ на остальных двух капель воды на парафильмом (Шаг 3,6 и 3,7 могут быть пропущены, если образец очень чувствительна к воде).
8. Float ЭМ гриD сразу на поверхности первой капли раствора UF справа после избытка воды на сетке EM был удален. А потом инкубировать в течение 10 сек. Убедитесь, чтобы закончить процедуру мытья воды в пределах 3 сек до плавающей сетки на поверхности раствора UF. Чем короче время стирки, тем лучше качество будет.
9. Очистите пинцеты, проникая ее концы в фильтровальную бумагу для ~ 2 - 3 раза.
10. Снимите излишки раствора на сетке через контакт сетки край с фильтровальной бумаги, а затем плавают сетку на второй капли UF.
11. Продолжить выше шаг 3,10 на втором капли.
12. Float сетку на третьей капли раствора UF и самого окрашивания станцию ​​для ~ 1 мин.
13. Дополнительный этап: мыть сетку быстро на верхней части воды, как описано в 3.6. Этот дополнительный шаг пойдет на пользу образцы, содержащие более нагруженных свободных частиц золота или пятен фоне.
14. Снимите излишки раствора, коснувшись фильтровальную бумагу к йВесь электронной сетки задней (напротив углерода стороне). Сушат сетку в слабом токе азота при комнатной температуре сразу после наблюдения поглощающего к фильтровальной бумаге раствором.
15. Поместите сетку на листе фильтровальной бумаги внутри чашки Петри, и самого блюдо частично с кепкой, чтобы высохнуть в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. Для некоторых образцов, поместите сетку в 40 ° С инкубатор выпечки в течение часа.
16. Храните сетку в сообщение сетки окна EM для будущего EM изучения.

4 EM экспертизы

1. Совместите ПЭМ должным образом перед EM экспертизы малых белков на сетке.
   1. Проверьте разрешение высшего видимого Тон-кольцо, которое является спектр мощности аморфной углеродной пленки для определения ТЕА был выровнен. С ТЕА разделяют многие разных пользователей, ТЕА часто не выровнены.
   2. Тщательно проверьте спектр мощности на площади углеродной пленки образца для выравнивания отелю обн машины. Самые высокие видимые Тон кольца лучше, чем целевой резолюции.
      Примечание: В качестве примера правильного выравнивания LaB6 нитей, работающим в соответствии ТЭМ 120 кВ высокого напряжения, более 20 Тон кольца могут быть визуализированы, в котором, соответствующее решение может быть лучше, чем 5,0 Å. Это Thon кольцо было достигнуто переводом Фурье аморфной углеродной пленки изображаемого под расфокусировки ~ 1,6 мкм и дозе 20,4 электронной / a2 (рисунок 5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдение высокого разрешения Тон-кольца является необходимым условием, но не достаточным условием для правильного выравнивания. Чтобы действительно достичь изображения с высоким разрешением, многие другие параметры также важны, как качество образца, радиационное повреждение, зарядки и дрейфующего а также мощности дозы освещения.
2. Принесите расфокусировки обратно в ближайшем Scherzer фокусе для визуализации малых белков на идеально витражного области.
3. Поиск "облачного" области к ИМАГэ. Идеально окрашивали площадь, как правило, находится на краю более толстым области пятен, которая выглядит как "облачный" области на сетке так как толщина пятна, как правило, не равномерно распределены по угольной пленкой сетки (рисунок 6). Обычно малое увеличение (<100x) было помочь найти эти мутные области, прежде чем масштабирования для визуализации.

Результаты

Реализации маркировок включают структурные и морфологические обследования различных липопротеинов видов, таких как: зарождающейся рекомбинантного HDL (рЛВП), сферической рекомбинантного HDL, плазменный ЛПВП, ЛПНП, IDL и ЛПОНП (рисунок 2) ^30; а также небольшие белки, такие как 53 кДа ПООППО (среди самых маленьких белков успешно отображенных через EM) (Рисунок 3) ⁶ и 160kDa IgG антител (один из самых динамичных и гетерогенных белков) (Рисунок 4) ^4,5,29,52 , даже 28 кДа липидов бесплатно аполипопротеина А-1 (Рисунок 2 л), и GroEL и Протеасомы (Рисунок 2М и N).

Другие примеры маркировок как метод высокой пропускной изучают белок-белковых взаимодействий для раскрытия механизмов белок, такой как 53 кДа СЕТР. Как описано во введении, как ХЭТБ взаимодействует с различными подклассов липопротеинов были InvestigaТед через изучение более 400 EM образцы ⁶ Насколько мы знаем, не было такой случай из крио-ЭМ исследования, состоит в обследовании почти сто различных условий.

Маркировок может расширить границы EM изучать малого и асимметричный белок 3D структуру и даже расширить для достижения 3D структура образуют единую и индивидуальный белок (без усреднения). Например, IgG-антитело 160 кДа молекулу с очень гибкой структурой, в которой реконструкции 3D в промежуточном разрешением будет сложно достичь. Способ маркировок был использован для изображения индивидуальный IgG антитела из серии углов наклона (Рисунок 4E и H). По разумным высоким разрешением и высокой контрастностью белковые изображения из маркировок, разрешенных для успешной реконструкции одного белка путем индивидуального электронного частиц томографии (МПГЭ) (Рисунок 4E - J) ^4,5. В МПГЭ 3D реконструкции 4, наклон серии 2D из адресной антител постепенно выравнивается по их расчетной глобального центра через впоследствии итерационного реконструкции для достижения плотности 3D с разрешением ~ 14.1 (Рисунок 4F и G) ^4. По той же подхода, один антитело-пептидный комплекс был реконструирован, и пептид индуцированной внутреннего домена конформационные изменения одной частицы антител был обнаружен (рисунок 4I и J, разрешение ~ 16.6 Å) ^4,5. Сравнивая 3D реконструкции из разных отдельных частиц, структурный анализ может позволить нам выявить белок термодинамических флуктуаций, и даже "моментальный снимок" промежуточных стадиях химической реакции ^{4,5,29,53,54.}

Таким образом, белки с молекулярной массой от 40 кДа - 200 кДа являются сложными для стандартных ЭМ структурных обследований и реконструкций. Учитывая, что более 50%Белков имеют молекулярную массу в пределах от 40 - 200 кДа ^1,2, мы сообщаем метод маркировок как надежный и высокой пропускной инструмент настаивать обычную EM границу в сторону малого и асимметричных структурных определений и даже механистических исследований.

Рисунок 1. ROULEAU артефакт липопротеинов обычными отрицательными окрашивание (NS) EM. Электронные микрофотографии (выше панелей) и выбранные частицы (ниже) панелей показывают различные липопротеины с ROULEAUX после NS с фосфорно-вольфрамовой кислоты (PTA) под стандартной процедуры смешивания. (А) Восстановленный ЛПВП (рЛВП) с ApoE4, (В) АроА-I, содержащий 9,6 нм дискообразный рЛВП, (С), содержащий апоВ плазмы LDL, (D), не содержащий аполипопротеина-POPC липосом. Бары: 50 нм. Размер окна: А и С, 20 нм; В, 30 нм. Журнал липидов исследований изначально размещено эту работу ^29,30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2 Структура белка оптимизированной отрицательного окрашивания (маркировок) ЭМ Электронные микрофотографии показывают различные липопротеины и липосомы без монетных столбиков артефакта, маркировок (А) apoE4 содержащих рЛВП;.. (В) 7,8 нм рЛВП; (С) 8,4 нм рЛВП; ( D) 9,6 нм рЛВП; (Е) 9,3 нм сферической рЛВП; (F) плазмы человека α-ЛПВП; (G) ЛВП в плазме, (h) Человеческий ЛПНП плазмы (I) в плазме человека IDL; (J) человека ЛПОНП в плазме; (К) POPC липосомы; (L) липидов бесплатно апоА-я. Дополнительная проверка была сделана с помощью (M) GroEL и (N) протеасома образцы. Микрофотографии (выше панели) и выбранные частицы (ниже панелей). Бары: 50 нм. Размер окна: - D, 20 нм; E и F, 25 нм; Г, 20 нм; H, 25 нм; Я, 50 нм; J и К, 100 нм; L, 80 нм., За исключением липидов свободного апоА-I, GroEL и протеасома, Это исследование было первоначально опубликовано в журнале липидов исследовательского ^29,30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 маркировок электронные микрофотографии ПООППО. () Обзор микрофотография с СЕТР (пунктирная кругах) банан в форме частиц. (B) WindoweD Выберите сырые частицы. (C) Три отдельные сырые СЕТР изображения частиц ясно показывая больше, тяжелее и больше шаровидную наконечник включая другой меньше, легче и более узким наконечником (левая панель), вид сверху, показывающий аналогичные терминальные области с меньшим общим кривизны (средний панель), и вид с торца по длинной оси ПООППО (справа) (D) Наложение кристаллическую структуру (PDB:. 2OBD) на этих сырьевых СЕТР изображений частиц, хорошо сочетается как в структурной формы и домена размера показывая ориентацию может быть почти непосредственно определяется даже без помощи со стороны компьютера (соответствующего панели (С)). (E) Рег бесплатно усредняет 2D класса (процесс неэмпирического вычислить сходство (расчет кросс-корреляция) этих случайно ориентированных частиц, причем частицы имеют высокое сходство друг с другом были сгруппированы, выровнены и затем усредняются для уменьшения фонового шума и повысить изображения кон частицконтраст. Средние класса бесплатно 2D ссылки не рассчитываются с помощью программного обеспечения refine2D.py в пакете EMAN, в котором, не любой человек сделал начальная модель была вовлечена в этот среднем классе. Средние опорного класса может быть использован в качестве независимого способа для проверки 3D-реконструкции с реконструкцией одночастичном). (F) выбранного опорного свободные средние 2D класса показывают больший дистальный конец сравнению с другой. (G), наложенную структуру кристалла (PDB : 2OBD) сравнение со свободными средних справочных, наложение изображения показывают практически идеальный матчей между кристаллической структуры и безопорной класса среднем как по форме структуры и размера домена (низкий панели) (F) плотность 3D-карта ПООППО в. разрешение 13 Å был реконструирован из 8879 частиц, отображаемых маркировок и метода реконструкции одночастичное (верхняя панель) и ребристых тела пристыкован в этой реконструкции одночастичном по кристаллической структуры (низкой панели). Detбеспокоило информация реконструкции одной частицы, в том числе изображения предварительной обработки, исходной модели, процедуры уточнения, углового распределения и Фурье Shell корреляции (FSC) были опубликованы в методическом разделе и вспомогательную информацию из оригинальной работе (H) Final сравнение реконструкции одной частицы ( выше панели) и дополнительного PDB подходят сравнения (нижняя панель) ^6. Бары: A, 50 нм; B - D, 10 нм; Ж, 3 нм. Некоторые из этих фигур были ранее опубликованы в Nature Chemical Biology ^6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фигура 4 маркировок изображения и реконструкции человеческого IgG частиц 1 антител. (А) Завид человеческих образов антитело IgG1 маркировок. Частицы, приведенные в белых кругах четко отображать частицы с 3 поддоменов. (B) Выбранный необработанных изображений с высоким разрешением из пяти отдельных неконъюгированных антител частиц и (С) соответствующие им с уменьшенным шумом изображений вручную уменьшения шума окружающей край сырой частиц (без прикосновения любого Плотность внутри частиц), чтобы легко визуализировать. (D), кристаллическая структура (PDB запись 1IGT) из IgG1 антитела, которое было ориентировано на просмотр аналогично изображениям ЭМ. Сравнение соответствующих изображений показывает много общих черт между изображением EM и кристаллической структуры, в том числе позиций домена и форм. (E) Процедура шаг к шагу из неэмпирические 3D реконструкции от одного экземпляра антитела IgG1 (не средняя, один отдельный объект) с помощью метода индивидуально-частиц электрон томографии (МПГЭ). (F) Окончательный 3D реконструкция сиngle частиц антитела при разрешении 14,1 Å показали три пончика в форме домены формирования в "Y" формы. (G) Docking доменов кристаллические структуры в каждой из соответствующих плотность домена отображает соответственно, и вручную повторять петли среди областей. (H) Процедура шаг к шагу 3D-реконструкции одной IgG-пептид (без среднем, один человек объекта) по МПГЭ. (Я) Окончательный 3D реконструкция пептидного комплекса IgG был показан при разрешении 16,6 Å показали три стержня формы домены, образующие в "Y" формы (J) соответственно, Док кристаллическую структуру каждого доменов IgG антител (PDB запись: 1IGT). друг в плотностях формы стержня показал плохо соответствие с доменом кристаллических структур, предлагая конформационные изменения внутренней домена после пептидной сопряжения. Подробная процедура, анализ разрешение и статистические данные были описаны в оригинальной работе 5 баров: A, 50 нм; B - D, 10 нм. Эта работа первоначально опубликованы в PLoS ONE ⁴ и научные доклады ^5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 Спектр мощности аморфного углерода фильме изображается под 1,6 мкм расфокусировки на Zeiss Libra 120 LaB6 ТЭМ. Высокого разрешения изображений требует достаточных доказательств, чтобы показать, что EM имеет надлежащего выравнивания и высоким разрешением возможности. Анализ спектра мощности близлежащего отеля углерода на сетке является эффективным методом проверить состояние когерентности луча до приобретения данных. Передача Фурье образа аморфной области углерода показать ЧКХ инструмента связаны (C TF), так называемый Thon кольца. Правильное выравнивание и согласованность может быть отражена на количество видимых Тон кольца и максимальном разрешении видимых колец Thon под относительно высоким состоянии расфокусировки. В качестве примера в ближайшем надлежащем состоянии выравнивания лаборатории ₆ нитей оборудованной ТЭМ, более ~ 20 Тон кольца (~ 5 Å) могут быть получены из углеродной пленки загружаются на 1,6 мкм расфокусировки использованием доза 20,4 е ^- / A ^2. Кольца Тон достигнутые с низким уровнем конца ТЭМ есть же, от высокого уровня TEM, такие как пистолет автоэмиссионный (FEG) повышенной ТЭМ, работающим в соответствии надлежащем состоянии выравнивания. Эта работа изначально публиковались в научных отчетах ^5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

6highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рис.6 Пример микрофотографии «идеальных» областей для визуализации маркировок. Три образцы белка, (А) GroEL (B) Протеасома (C) Сферические HDL, были использованы в качестве примеров для демонстрации идеальных маркировок для визуализации. Поскольку пятна распределены неравномерно в образце, с низким уровнем увеличения образца, как правило, появляется "Облачный" (крайняя левая панель). Идеальные участки для визуализации, как правило, расположены в границах этих "облаков". Примером шаг за шагом зум-в одном "облачного" пятен области (левая средняя панель) показать увеличивающим изображения, представляющие с высоким разрешением и высокой контрастностью изображений частиц (правая средняя панель). Выбранные снимки частиц показать структуру детали белков (правая панель). Бары:. 30нм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большоег версия этой фигуры.

Рисунок 7 схема процедур маркировок. () EM сетки Инкубационный станция, просто станция для инкубации раствор образца на тлеющем разряженный сетке. (B) Окрашивание рабочая станция, предназначена для поддержания стиральные капли воды, и капли пятен Над кроватью льда, при сведении к минимуму воздействия пятно света. (С) Обзор процедуры окрашивания, иллюстрирующая: блоттинга направлении, промывку 3x, 3x УФ облучение пятна, окрашивание инкубации образца с перевернутым на сетке капель пятен, и последний образец задней блоттинга, чтобы обеспечить тонкий слой раствора образца пятен перед сушкой путем азот воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию гоявляется фигурой.

Рис.8 высокая - в ​​более высоком разрешении изображения 53kDa небольшой белка ПООППО раскрыться с модифицированным методом маркировок, крио-положительного окрашивания (крио-PS) Five выберите высокого разрешения и круглую форму мягкие масках сырые изображения БПЭХ частиц (с обратной отличие). и форма частиц маскируется сырые частицы (вручную снижение уровня шума, окружающие края сырые изображения частицы ", но без изменения плотности внутри частиц) легко визуализировать. All-атом и сравнение структура ленты кристалл маскируется сырые частицы, увязанные с аналогичными ориентаций каждой частицы к ЭМ изображений. Детали с высоким разрешением исходных областей изображения отображения определенное сходство с кристаллической структурой, в то время как не все функции кристаллическая структура может быть решена с исходных данных. Ремарка Блай, эти сырые изображения показывают сходство в обоих концевых имея рядом небольших круглых отверстий видели вручную снижения шума изображений (треугольники); Кроме того, нити в С-концевых областей в пределах изображений частиц дополняют кристаллическую структуру β-листов (стрелки) и, наконец,, выступающие петли на СЕТР C-концевой области сродни в кристаллической структуре (ромбы). () Пять выберите с высоким разрешением и круглой формы мягкие масках сырые образы СЕТР частиц (с обратной отличие). (B) Low Pass фильтрации в 10а. (C) Высшее Low Pass фильтрации в 20а. (D) в масках вручную шум уменьшенных изображений. (E) сравнение Кристаллическая структура лентой структуры. сравнение структура (F) Кристалл всеми представления атома. Бар: 5 нм. Часть этой работы была опубликована в Nature Chemical Biology ^6.худощавый "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9 Электронные микрофотографии липосом, показывающих ROULEAU образование по традиционной протокола NS (ПТА пятен) под отличающихся солености. () Высокая соленость (~ 0,5 MNaCl). (B) Регулярный соленость (~ 0,25 М NaCl). (C) Низкая соленость (~ 0,1 М NaCl). (D) Чистая вода. Микрофотографии (выше панели) и выберите оконный частицы (ниже панели) показаны. Бары: 100 нм. Размер окна: 80 нм. Журнал липидов исследований впервые опубликована эту работу ^30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

По сравнению с традиционными методами NS, маркировок может предотвратить ROULEAUX артефакты (рисунок 1 и 9), обеспечивающие надежную и разумную высоким разрешением (~ 1 нм) структурные детали небольших белков (рисунок 2). По сравнению с крио-ЭМ, маркировок обеспечивает высокую пропускную способность и метод может исследовать широкий спектр белков и белок-белковых взаимодействий ^6. Тем не менее, маркировок еще имеет свои недостатки. По сравнению с обычными NS, маркировок влечет: I) более сложные шаги в подготовке образцов; II) с использованием радиоактивного вещества, UF; III) по поддержанию пятно свежей вследствие более короткого потенции UF пятна, потому что его чувствительность к свету; IV), чтобы предотвратить осаждение раствора UF должны храниться в -80 ° С, и требуется оттаивание перед использованием; V) и, наконец, все UF необходимо обращаться как с опасными отходами. По сравнению с крио-ЭМ, маркировок обеспечивает относительно низким разрешением и никакой ответственности за еще не открытой артефактав будущем.

Работа NS процессуальные влияние на формирование липопротеинов монетных столбиков

Протоколы NS для подготовки белки на экспертизу ^16,29-36,55 можно разделить на три основные группы методов ^50: смешивания ^55, занесите по-капли ¹⁶ и стиральных процедур ^29. я) Протокол смешивания требует предварительного смешивания красителей и белков образца в определенном соотношении, и затем применяя смешанный раствор на углеродной пленки, покрывающей сетке, наконец удаления избытка раствора фильтровальной бумагой перед воздушной сушки для экспертизы EM ^55. II) Протокол падение на капли включает в себя применение (~ 4 мкл) образца капли непосредственно к EM сетки, покрытой углерода позволяя сидеть в течение ~ 1 мин, с последующим удалением избытка раствора образца перед нанесением капли (~ 4 мкл) пятна Решение на той же стороне сетки. После ~ 1 мин инкубации, удалить excesс пятном через контакт с чистой фильтровальной бумаги, наконец представления для сушки на воздухе ^16,56-58. III) Протокол стиральная (фиг.7), что требует применения раствора образца к EM сетки, покрытой углеродом в течение 1 мин, затем промывают деионизированной водой три раза сразу после удаления избытка раствора каждый раз фильтровальную бумагу ^3,29,30. Маркировок протокол был изменен от этой процедуры промывки.

NS виды пятен и влияние на формирование липопротеинов монетных столбиков

В NS, сильнее рассеяние электронов за счет тяжелых металлов пятен обеспечивают контраст от белков ^17-20,59. Образцы NS может дополнительно страдают больше дозы облучения, и повышения возможностей белка с помощью острее отрицательной отличие ^8,9,60. Пятна тяжелых металлов могут быть классифицированы как: анионные, в том числе фосфорно-вольфрамовой кислоты (PTA) ^16, метиламин вольфрамата ¹⁴ и кремний вольфрамата ^61; и катионовIC, такие как уранилацетатом (UA) ^62, UF ^3,29,30, и уранилнитрата (ООН) ^63. Один из анионных пятен NS, который наиболее часто используемых является ПТА ^33,64-67. РТА является гетерополикислота, который обычно используется во всем рН 7,0 - 7,5. РТА также может быть использован для положительного окрашивания ^3,16,68. Негативные заряды ПТА может посредничать электростатические взаимодействия с ненасыщенными липидами положительно заряженных головных групп, как РОРС, с обеих липопротеинов и липосом поверхностей. PTA может привести ROULEAUX образование через этого взаимодействия ^29,30 даже под обычной буфер солености ^29,30 (рисунок 1). Уранила пятна, такие как UA, UF и ООН альтернативные варианты для катионных тяжелых металлов пятен и UA, в частности, часто используемых для NS разнообразных биологических образцов ^62,69,70. Эксперименты найдено UF не вызывает ROULEAUX липопротеинов, которые содержат ненасыщенные липиды жира кислот, такие как РОРС. Тем не менее, UF может еще вызвать RouleОбразование AUX на липопротеинов, которые содержат насыщенные липиды жирных кислот, такие как димиристоил фосфатидилхолин (ДМФХ) и 1-гексадеканоил-2-октадеканоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (PSPC). Подробное механизм этого взаимодействия не известно. UA / UF / ООН может все работы при более низких значениях рН в пределах от 3,5 до 4,6. Такие более низкие величины рН не могут подходить для определенных биологических макромолекул, которые чувствительны к рН ^14,71. Интересно, UA / UF может исправить структуру белка в течение нескольких миллисекунд через неизвестного механизма ^72. В отличие от ОТА, UA / UF больше похож на соль, чем кислоты.

UF сообщениям может обеспечить лучшие результаты, чем UA ^73, в котором, UF и ООН пятна имеют меньшие размеры зерен, чем UA (UF: 0,3 нм, ООН: ~ 0,5 нм) ^3,74. Интересный пример, вторичную структуру, как детали небольшой белок (53 кДа СЕТР) может быть непосредственно визуализировать из сырых микрофотографий при УФ был использован в качестве отрицательного пятна реагентом, следуяРанее сообщалось, крио-положительный-окрашивание (крио-PS) метод (Рисунок 8) ^6. В крио-PS, окрашенных образец заморожены, следуя крио-ЭМ процедуру подготовки образца вместо процедуру сушки в протоколе маркировок, которые могут вызвать вторичный структурный коллапс. Крио-PS является способ высокой контрастностью и изображений с высоким разрешением малых белков ^75. Поскольку изображения крио-PS, изменил контраст по сравнению с теми из отчетном протокола ²² крио-НС, но есть последовательное контрастность изображения для тех, от обычных изображений крио-ЭМ, таким образом, он был назван метод крио-PS. Изображения крио-PS показывают, что окрашивающий реагент, уранила формиат, проникает в молекулярную поверхность, бросая вызов традиционный взгляд, что окрашивание может визуализировать только внешнюю структуру поверхности. Механизм, как уранила формиат проникает в поверхность молекулярную неизвестно. Одна возможность состоит в том, что катион уранила связывает свободные карбоксильные группы белков, и, таким образомокружающих стекловидного льда имеет более низкую плотность, чем окрашивание белка и уранила групп, таким образом, действуя в качестве положительного пятна. Метод крио-PS похож на метод множественного изоморфного замещения (MIR), который был общий подход к решению фазовой проблемы в рентгеновской кристаллографии ^76-78. В МИР, образцы кристаллов замачивают с тяжелым решения атома, в том числе урана, чтобы получить изоморфный форму исходной форме. Добавление тяжелого атома иногда не влияет на образование кристаллов или единицы измерения элементов, но предоставляет дополнительную информацию определения кристаллической структуры ^76-78. По выгоду от небольшой зерна UF, крио-PS может обеспечить высокую контрастность и изображение высокого разрешения из одного белка, что очень важно для структуры белка исследований, особенно если учесть, что почти все белки, естественно, динамичный и гетерогенная в растворе. Для проверки этого метода крио-PS, мы открываем для любого слепого тестирования от ЭМ поля.

Концентрация соли воздействие на формирование монетных столбиков липопротеидов

Использование традиционных PTA отрицательный окрашивающий реагент, формирование наблюдается ROULEAUX более вероятно, связано с липидных взаимодействий вместо взаимодействия белка. Визуализация образцы POPC липосом пузырьков, подготовленных под значительным солености (0,5 М NaCl), умеренный солености (0,25 М NaCl), относительно слабый солености (0,1 М NaCl), и чистой воды (рисунок 9), электронные микрофотографии показывают формирование ROULEAUX было коррелирует с концентрацией соли (9А - D). Использование UF как отрицательный окрашивающий реагент, не ROULEAUX не наблюдалось в POPC липосомы пузырьков образца ³⁰ (Рисунок 2 л), что свидетельствует о процедуру промывки, чтобы быстро уменьшить концентрацию соли прямо перед окрашивание необходимо, но не самостоятельно достаточно шагом для предотвращения ROULEAUX в РОРС связанной Образцы.

томография ТЕМ небольшой белок требует фокусировки состояние почти Scherzer.

Успешное TEM изображений малых белков с более высоким разрешением требуется два критических условий, надлежащее выравнивание луча и состояние сбора внимание почти Scherzer. я) собственно высоты света фар можно судить через количество видимых колец Тон (спектра мощности) о передаче Фурье углеродной пленки изображения, полученного при относительно высокой расфокусировки. Чем лучше состояние выравнивание луча, тем больше колец Тон могут быть визуализированы и измеримыми .. II) Получение изображения при ближайшем-Scherzer внимания еще один важный состояние. Традиционный стандартная стратегия для визуализации биологических образцов, как правило, использует высокую расфокусировки (1 - 2 мкм и даже больше), усиливающие биологический образец контрастность изображения ^79. Эта стратегия является существенным отличается от типичной стратегии для визуализации структуры атомарного разрешения твердых материалов, которые частоиспользует ближний фокус Scherzer (~ 50 нм) расфокусировки. Хотя, выше расфокусировки может усилить биологическую контраст образца, сигналы с высоким разрешением будут частично устранены. В результате, соучастие высокого разрешения сигнала будет ниже при более высокой состоянии изображений расфокусировки. Причина в том, что, ПЭМ-изображение есть свертка структуры образца и прибор CTF. ЦФК является осциллирующей кривой по отношению к частоте, на которой кривая часто колебалась пересечении нулевой амплитуды на высокой частоте. Каждый раз, когда ЦФК через нуль, образец структурная сигнал на этой конкретной частоты будут устранены (ноль раз любое количество будет равно нулю). Устранены сигнал на этой частоте не может быть выделен любым алгоритмом коррекции CTF (нулевой деленное на ноль может быть любое случайное число вместо оригинального структурного сигнала). При более высоком изображений расфокусировки, ЦФК будет колебаться гораздо более активно, таким образом, ЦФК пересекает нулевую амплитуду чаще, в результате чегоструктурные сигналы на большее количество конкретных частотах будут устранены. Чем больше сигналов, которые устранены, тем меньше соучастие изображение будет иметь. Примечательно, что соучастие изображения не могут быть восстановлены или исправить любой коррекции CTF. Тем не менее, количество незавершенного изображений, полученных при различных дефокусирует могут быть использованы, чтобы заполнить пробелы их друг с другом, чтобы полученной заполненной структурной сигнала структуры образца с помощью метода усреднения, в котором даже атомное разрешение может быть достигнуто ^9-12.

Метод усреднения представляет собой мощный подход к достижению структуру некоторых высоко симметричных белков и структурно родственных белков жестких. Тем не менее, он все еще остается сложной в структурном исследовании малых и асимметричных белков, особенно для структурной динамики и гибких белков, таких как антитела и ЛПВП. Усреднение основан на предположении, что белковые частицы идентичны по структуре и конформации, но диили цепи в ориентации, однако многие белки, как известно, подвергаются термодинамической флуктуации в растворе. Применяя метод усреднения без предварительного зная белковые термодинамических флуктуаций флуктуации, усредненная структура может часто вызывать отсутствует домены ^10,80 или локальное изменение в резолюции ⁸¹ в крио-ЭМ реконструкций.

Успех в достижении 3D реконструкции небольшого белка, такие как 53 кДа СЕТР, и 3D структура одного белка, такие как 160 кД антитело IgG1, выгоды от используя условие формирования изображения вблизи фокуса-Scherzer в надлежащем состоянии выравнивания. Хотя контраст изображения кажется низкой в ​​ближайшем Scherzer фокус изображений, контраст может быть легко повышена путем простого применения фильтрации нижних частот, чтобы уменьшить высокочастотный шум в фоновом режиме. Мы считаем, почти Scherzer сосредоточиться изображения несут максимальные структурные сигналы, и может увеличить точность выравнивания частиц и повышения Эффифективность в одночастичном 3D реконструкции и реконструкции электронов томографии отдельной частицы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stain: Uranyl Formate	The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.	02545-AA	http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
Syringe: 1 ml NORM-JECT	VWR	89174-491	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Syringe filter: 0.2 μm	VWR	28145-487	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10)	Whatman	6809-1002	http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-Aldrich	D8537	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US
Parafilm: 4 in. x 125 ft.	VWR	470152-246	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh	Pacific Grid-Tech	Cu-300CN	http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh	EMS (Electro Microscopy Sciences)	CF200-Cu	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Tweezer: Dumont Tweezer L5	EMS (Electro Microscopy Sciences)	72882-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System	EMD Millipore	Milli-Q Advantage A10	http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filter Paper: Grade 1 circles	Whatman	1001-090	http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Aluminum Foil			Any type
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors	VWR	89174-520	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
[header]
Glow Discharge Unit	Ted Pella	91000	http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors	VWR	89174-524	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips	VWR	37001-528	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet	Pipetman	F161201 and F167300	http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx