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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt werden kann, um in intakten Geweben entdecken und identifizieren verschiedene chemische Spezies, die Erhaltung der Verbindungen in ihrer natürlichen Umgebung, die neue Einblicke in die biologischen Prozesse zur Verfügung stellen kann. Hierin eine für die Analyse von kleinen Molekülen entwickelt MSI Verfahren beschrieben.

Zusammenfassung

Die meisten Techniken verwendet, um kleine Moleküle, wie Medikamente oder endogene Metaboliten studieren, verwenden Gewebeextrakten, die die Homogenisierung des Gewebes von Interesse, die möglicherweise Änderungen in der Stoffwechselwege untersucht 1 verursachen könnte erfordern. Bildgebenden Massenspektrometrie (MSI) ist ein leistungsstarkes Analyse-Tool, das in intakten Scheiben von biologischen Gewebeproben 1-5 räumliche Informationen von Analyten zur Verfügung stellen kann. Diese Technik wurde ausgiebig verwendet, um verschiedene Arten von Verbindungen, einschließlich Proteine, Peptide, Lipide, kleine Moleküle wie Metaboliten endogenen studieren. Mit Matrix-unterstützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)-MSI können räumliche Verteilungen mehrerer Metaboliten gleichzeitig detektiert werden. Hierbei wird eine speziell für die Durchführung von Metabolomics ungezielte MSI Experimente an Leguminosen Wurzeln und Wurzelknöllchen entwickelte Methode vorgestellt, das Einblicke in die biologischen Prozesse, die sich offenbaren konnte. Diehier vorgestellte Methode zeigt eine typische MSI Workflow, von der Probenvorbereitung bis zur Bildaufnahme, und konzentriert sich auf die Matrix-Anwendung Schritt und zeigt mehrere Matrix Anwendungstechniken, die nützlich für die Erkennung kleiner Moleküle sind. Sobald die MS Bilder erzeugt, wird die Analyse und Identifizierung von Metaboliten von Interesse diskutiert und gezeigt. Die hier vorgestellten Standard-Workflow kann leicht für verschiedene Gewebearten, Molekülarten, und Instrumentierung geändert werden.

Einleitung

Die wachsenden Bereich der Metabolomics hat viele wichtige biologische Anwendungen, einschließlich der Entdeckung von Biomarkern, die Entschlüsselung Stoffwechselwege in Pflanzen und anderen biologischen Systemen und Toxikologie Profilierung 4,6-10. Eine große technische Herausforderung bei der Untersuchung biologischer Systeme ist es, Wege metabolomic sie ohne Unterbrechung 11 studieren. MALDI-MSI ermöglicht die direkte Analyse von intaktem Gewebe, die sensitive Detektion von Analyten in einzelnen Organen und sogar 12,13 14,15 Einzelzellen ermöglicht.

Probenvorbereitung ist ein entscheidender Schritt in der Herstellung reproduzierbare und zuverlässige Massenspektren Bilder. Die Qualität der Bilder hängt stark von Faktoren wie Gewebeeinbettungsmedium, Schichtdicke, MALDI-Matrix und Matrix-Anwendungstechnik. Bei bildgebenden Anwendungen ist ideal Schnittdicke die Breite einer Zelle (8-20 um je nach Probentyp). MALDI erfordert Abscheidung einer organischen, Crystalline Matrixverbindung, typischerweise eine schwache Säure, auf die Probe, um einen Analyten-Ablation und Ionisierung zu unterstützen. 16 verschiedene Matrizen bieten unterschiedliche Signalintensitäten, störenden Ionen und Ionisierungseffizienz von verschiedenen Klassen von Verbindungen.

Die Matrix Applikationstechnik spielt auch eine Rolle, in der Qualität der Massenspektren Bilder und verschiedene Techniken für die verschiedenen Klassen von Analyten geeignet sind. Drei Matrix Anwendungsmethoden werden in diesem Protokoll vorgestellt: Airbrush, Spritzautomaten und Sublimation. Airbrush-Matrix-Anwendung wurde vielfach in der MALDI-Bildgebung verwendet. Der Vorteil der Airbrush-Matrix-Anwendung ist, dass es relativ schnell und einfach ist. Allerdings ist die Qualität der Airbrush Matrix Anwendung hängt stark von der Geschicklichkeit des Benutzers und neigt weniger reproduzierbar und führen Diffusion von Analyten, insbesondere kleine Moleküle 17. Automatische Spritze Systeme haben ähnliche Mechanik Matrix Anwendung Airbrush, aber have entwickelt worden, um die Variabilität mit manueller Airbrush-Anwendung gesehen zu entfernen, so dass das Spray mehr reproduzierbar. Diese Methode kann manchmal mehr Zeit in Anspruch als herkömmliche Airbrush-Matrix-Anwendung sein. Sowohl manuelle Airbrush und Spritzautomaten Systeme sind lösemittelbasierten Matrix Anwendungsmethoden. Sublimation ist eine trockene Matrix Applikationstechnik, die immer mehr und mehr populär für die Massenspektrale Bildgebung von Metaboliten und kleinen Molekülen, weil es Analytdiffusion reduziert, aber es fehlt die notwendige Lösungsmittel zu extrahieren und zu beobachten, höhere Massen 18 Verbindungen.

Zuversichtlich Identifizierung von Metaboliten erfordert in der Regel präzise Massenmessungen an vermeintlichen Identifikationen gefolgt von Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) Experimente zur Validierung, mit MS / MS-Spektren, die verglichen werden, um Standards, Literatur oder theoretischen Spektren zu erhalten. In diesem Protokoll hoher Auflösung (Massenauflösungsvermögen von 60.000 bei m / z 400), Flüssigchromatographie (LC)-MS ist mit MALDI-MSI gekoppelt, die die Rauminformationen und zuversichtlich Identifikationen von endogenen Metaboliten zu erhalten, mit Medicago truncatula Wurzeln und Wurzelknollen als das biologische System. MS / MS-Experimente können direkt auf das Gewebe mit MALDI-MSI-oder Gewebeextrakten mit LC-MS durchgeführt und für die Validierung der Metabolit Identifikationen verwendet werden.

Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um endogene Metaboliten in M. Karte truncatula, die angepasst und MSI von kleinen Molekülen in verschiedenen Gewebetypen und biologische Systeme angewandt werden kann.

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Protokoll

1. Instrumentierung

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit einer MALDI-Quelle für die Analyse von kleinen Molekülen ausgestattet (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). Führen Akquisitionen im positiven oder negativen Ionen-Modus in Abhängigkeit von den Analyten von Interesse. Geben Sie einen Massenbereich von Interesse und sammeln Sie 500 Laserschüsse / Spot bei 50 Intervallen um sowohl in der x-und y-Richtung über die Oberfläche der Probe auf Ionen-Bilder zu erzeugen. Die Rasterweite und die Anzahl der Laserschüsse eingestellt werden, um eine höhere räumliche Auflösung und maximalen Signalintensität bzw. zu erhalten. Verwenden DHB Matrix Peaks oder der Folie oder direkt auf das Gewebe aufgebracht, um die Massenspektren kalibrieren internen Standards.
  2. Hohe Auflösung LC-MS. (Siehe Tabelle der Materialien / Geräte) Führen Probenextrakten mit LC-MS entweder mit Reversed-Phase (RP) LC mit einer C-18-Säule oder Normalphase (NP) mit einem HILIC Säule in Abhängigkeit von den Analyten von Interesse. Verwenden Sie mobile Phasen undGradienten für das entsprechende speziellen Probentyp. Führen Akquisitionen in positive oder negative Ionen-Modi, je nach Probentyp.

2. Gewebepräparation

  1. Schneiden Sie die Wurzelknöllchen aus der Pflanze, so dass 3-4 mm der Wurzel zum Knoten befestigt.
  2. Unmittelbar nach der Sektion, Zange verwenden, um das Gewebe in einem Kryostaten Tasse legen und decken mit Gelatine (100 mg / ml in VE-Wasser). Es ist für das Gewebe an der Unterseite der Schale ohne Luftblasen aufgeklebt werden.
  3. Blitzeis das Gewebe, indem Sie den Becher in einem Trockeneis / Ethanol-Bad, bis die Gelatine erstarrt und wird undurchsichtig. Proben bei -80 ° C bis zur Verwendung.
  4. Proben entfernen aus dem -80 ° C Gefrierschrank, schneiden Sie den Kunststoffbecher und-Kryostaten wegschneiden überschüssige Gelatine. Montieren Sie den eingebetteten Gewebe mit dem Kryostaten Spannfutter mit einer Dime-Größe Menge der optimale Schnitttemperatur (OCT) Medien, die zwar nicht gerade der Oktober berühren das Gewebe. Legen Sie in KryostatenBox, bis die Oktober erstarrt.
  5. Damit das Spannfutter und Gelatine in den Kryostaten Feld (auf -20 oder -25 ° C) für etwa 15 min äquilibrieren.
  6. Verwenden Sie den Kryostaten (siehe Tabelle der Materialien / Geräte), um Gewebeschnitt etwa die Dicke einer Zelle (8-20 um je nach Gewebetyp) und Tauwetter montieren jede Scheibe auf die ITO-beschichtetes Glas durch Erwärmen der Rückseite (nicht-ITO beschichtete Seite) einer ITO-beschichtete Glasträger auf der Rückseite der Hand. Legen Sie die ITO-beschichtete Seite der Folie erwärmt in der Nähe des eingefrorenen Gewebeschnitt und damit die Scheibe, um auf der Folie haften. Platzieren Sie die Abschnitte nahe beieinander auf der Folie wird die bessere Ausrichtung bei MSI bieten.

3. Matrix-Anwendung

  1. Airbrush Anwendung der MALDI-Matrix
    1. Alle Airbrush-Verfahren sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
    2. Die Airbrush-Lösung Behälter und Düse (siehe Tabelle der Materialien / Geräte) mit Methanol gründlich reinigen undFüllen der Lösungsbehälter mit DHB-Matrix-Lösung (150 mg / ml in 50% methanol/0.1% TFA v / v).
    3. Halten der Spritzpistole etwa 35 cm von der Probe und anzuwenden 10-15 Schichten Matrix auf der Oberfläche des Objektträgers mit einer Dauer von 10 Sek. und 30 Sek. Spritztrockenzeit zwischen jeder Beschichtung.
    4. Gründlich die Airbrush wieder sauber, wenn Sie fertig mit Methanol, um zu vermeiden Verstopfung von der Matrix-Lösung.
  2. Automatische Sprayer Anwendung der MALDI-Matrix
    1. Folgen Sie den Start-up-Anleitungen der Hersteller von automatischen Spritzgerät System.
    2. Für MSI von Metaboliten in Wurzelknöllchen mit 40 mg / ml (in 50% methanol/0.1% TFA v / v) DHB als Matrix, die Temperatur auf ~ 80 ° C, Geschwindigkeit bis 1250 mm / min, Durchflussrate auf 50 ul / min, und die Anzahl der Durchgänge 24. Für beste Leistung wird empfohlen, um die Düse 90 und / oder versetzt die Düse von 1,5 mm zwischen jedem Durchlauf drehen. Starten Sprayer-Methode.
      Als side Note, insbesondere die Spritzensystem verwendet hier heizt die Düse zur schnelleren Verdampfung des Lösungsmittels. Wenn das Lösungsmittel verdampft, wobei die Konzentration des Matrix schnell erhöht. Die mit der Airbrush und dem Spritzautomaten auf die Probe aufgebracht Matrix vergleichbare Konzentrationen.
    3. Folgen Sie den Anweisungen Abschaltung der Hersteller von automatischen Spritzgerät System.
  3. Sublimation Anwendung der MALDI-Matrix
    1. Wiegen Sie 300 mg DHB in den Boden des Sublimationskammer (siehe Tabelle der Materialien / Geräte).
    2. Kleben Sie den Glasobjektträger zu der kalten Finger (obere Teil des Sublimationskammer) mit den Gewebeschnitten nach unten mit einem doppelseitigen, leitfähiges Band. Decken Sie die gesamte Rückseite der Folie mit dem doppelseitigen Klebeband selbst für Leitfähigkeit, wodurch auch Matrix-Abscheidung.
    3. Klemmen Sie die oberen und unteren Hälften der Sublimation Kammer zusammen mit der C-Klemme. Verbinden Sie den Vakuum-und Ad-d Eis und kaltes Wasser an die Spitze Reservoir.
    4. Platzieren Sublimationskammer in einem Heizmantel bei Raumtemperatur.
    5. Einschalten der Vakuumpumpe. Warten Sie 15 min und die Heizung andrehen Mantel. Der Heizmantel sollte 120 ° C im Verlauf von 10 min zu erreichen.
    6. Nach 10 min, schalten Sie die Hitze, in der Nähe der Vakuumventil (so das Innere der Kammer bleibt unter Vakuum), und schalten Sie die Vakuumpumpe.
    7. Lassen Sie die Kammer auf Raumtemperatur zu kommen, öffnen Sie das Ventil das Vakuum Druck und entfernen Sie die Probe. Die Größe der Kammer Sublimation wird die Höhe der Matrix zu dem Glasobjektträger sublimiert bestimmen. Die größeren Sublimation Kammern (die Größe einer 400 ml-Becherglas) werden ca. 300 mg HTB während die kleineren Kammern (die Größe einer 150 ml-Becherglas) werden ca. 100 mg HTB und erfordert Schneiden der Glasplatte, so dass es passt in die Kammer.

4. Image Acquisition

  1. Mark a + Muster auf jeder Ecke der Probe mit einem WiteOut Korrekturflüssigkeit Stift als "lehren Punkte" verwendet werden. Setzen Sie den Glasobjektträger in die MALDI Dia-Adapterplatte und nehmen Sie ein optisches Bild der Probe mit Hilfe eines Scanners.
  2. Einrichten einer Bildaufnahme-Datei unter Verwendung der von der Firma Instrument mit einer Rasterschrittweite von 50 um und einer Laserdurchmesser gleich oder kleiner als die Rasterschrittweite vorgesehen Software. An diesem Instrument, der minimale Lasereinstellung gibt einen Laserdurchmesser von etwa 10 um und kleinen Lasereinstellung hat einen Durchmesser von 40 bis 50 um.
  3. Laden des optischen Bildes in die Software und Ausrichten der Platte mit dem optischen Bild.
  4. Kalibrieren Sie das Gerät vor Beginn der gemeinsamen Akquisition mit Matrix-Clusterionen, interne Standards oder eine Kalibrierung Mix.
  5. Geben die Bereiche des Gewebes mit MSI analysiert werden, einschließlich einer Stelle der reinen Matrix auf der Folie als "blank" verwendet werden.
  6. Beginnen acErwerb.

5. Bildgenerierung

  1. Öffnen Sie die Bilddatei in der handelsüblichen Software, die vom Hersteller bereitgestellt und extrahieren Sie die Ionen-Bilder. Andere Open-Source-Software ist für MSI 19 Datenverarbeitung zur Verfügung.

6. Identifizierung von Metaboliten

  1. Wählen Sie einen bestimmten m / z von Interesse aus dem Massenspektrum mit der herstellerspezifischen Software (siehe Tabelle der Materialien / Geräte). Ein Analyt kann aus einem Matrix-Ionen unterschieden werden, wenn ein Analyt ausgewählt ist aus Peak im Massenspektrum und Ionen Bilder erzeugt werden spezifisch an den Gewebeabschnitt zu lokalisieren.
  2. Erstellen Sie eine Liste von Analyten von Interesse und führen Sie MS / MS-Experimente. Siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 in Repräsentative Ergebnisse für die Probenlisten von Analyten.
  3. Führen Sie gezielt LC-MS-Analyse auf einem hochauflösenden Massenspektrometer (oder hoher Auflösung MALDI-MS falls vorhanden) genau zu erhaltenMassenmessungen der Analyten von Interesse und führen auch LC-MS/MS der Ziel Analyten charakteristischen Fragmentierungsmuster zu erhalten.
  4. Führen Datenbank suchen, um vermeintliche Identifikationen für die Ziel Analyten zu bestimmen. Beispiele für Stoffwechsel Datenbanken enthalten: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG und HMDB.
  5. Um die vermeintlichen Identifikationen von genauen Massendatenbanksuche bestätigen, passen Sie die MS / MS von den gezielten Analyten MS / MS-Spektren von Standards, Literatur und / oder Splitter Vorhersage-Software.

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Ergebnisse

Ein Überblick über experimentelle MSI ist in Fig. 1 gezeigt. Am Anfang des Experiments ist die Probenvorbereitung ein kritischer Schritt. Knöllchen aus der Pflanzenwurzel geschnitten und in Gelatine eingebettet. Das Gewebe muss flach gegen den Kryostaten Tasse gedrückt werden, ohne Blasen, während es eingefroren wird, das wird einfacher und die richtige Ausrichtung des Gewebes zu gewährleisten, während es geschnitten ist. Wenn das Gewebe in Scheiben geschnitten wird, ist es wichtig, das Gewebe be...

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Diskussion

Wie oben diskutiert, ist die Probenvorbereitung der wichtigste Schritt in der MSI Workflow. Die Einbettung des Gewebes verursachen ungleichmäßig Schneiden schwierig oder in einigen Fällen nicht möglich zu sein. Der Abschnitt Größe und angemessene Ausgleichszeit sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität und Vermeidung von Falten und Tränen. Auswahl der Matrix-und Applikationstechnik eine Rolle bei der Bestimmung der Arten von Analyten zu erfassen ist, die räumliche Auflösung und Reproduz...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Jean-Michel Ané in der Abteilung für Pflanzenbau an der UW-Madison für die Bereitstellung von Medicago truncatula Proben bestätigen. Diese Arbeit wurde zum Teil aus Mitteln der National Science Foundation (NSF) unterstützt Zuschuss CHE-0957784, der Universität von Wisconsin Graduate School und der Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) und Romnes Fakultät Research Fellowship-Programm (LL). EG quittiert eine NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1256259).

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
GelatinDifco214340heat to dissolve
Cryostat- HM 550Thermo Scientific956564A
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix ICN BiomedicalsPI90033
AirbrushPaasche Airbrush CompanyTG-100Dcoupled with 75 ml steel container
Automatic matrix sprayer system- TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX.TMSP.H021-USpecific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed
Sublimation apparatus Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Vaccum pump- Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics276601
FlexImagingBruker Daltonics269841One example of "vender specific software"
MALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZHigh resolution MALDI instrument for accurate mass measurements
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRHigh resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements

Referenzen

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