MALDI-Mass spettrometria di imaging per le inchieste sui metaboliti in<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Root noduli

Riepilogo

Mass spettrometria di imaging (MSI) è un potente strumento che può essere utilizzato per scoprire e identificare le varie specie chimiche nei tessuti intatti, preservando i composti nel loro ambiente naturale, in grado di fornire nuove intuizioni in processi biologici. Qui un metodo MSI sviluppato per l'analisi di piccole molecole è descritto.

Abstract

La maggior parte delle tecniche utilizzate per studiare piccole molecole, come farmaci o metaboliti endogeni, impiegare estratti tissutali che richiedono l'omogeneizzazione del tessuto di interesse che potrebbe potenzialmente causare variazioni nelle vie metaboliche in fase di studio ^1. Mass spettrometria di imaging (MSI) è uno strumento di analisi potente che può fornire informazioni spaziali di analiti all'interno fette intatto di campioni di tessuti biologici ^1-5. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare vari tipi di composti tra cui proteine, peptidi, lipidi, e piccole molecole come metaboliti endogeni. Con matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI)-MSI, distribuzioni spaziali di più metaboliti possono essere rilevati simultaneamente. Qui, un metodo sviluppato specificamente per lo svolgimento di mirati metabolomica MSI esperimenti sulle radici di legumi e noduli radicali viene presentata, che potrebbe rivelare intuizioni processi biologici che avvengono. Ilmetodo qui presentato mostra un flusso di lavoro tipico MSI, dalla preparazione del campione per l'acquisizione delle immagini, e si concentra sulla fase di applicazione matrice, dimostrando diverse tecniche applicative matrice che sono utili per rilevare piccole molecole. Una volta che vengono generate le immagini MS, l'analisi e l'identificazione dei metaboliti di interesse è discusso e dimostrato. Il flusso di lavoro standard qui presentato può essere facilmente modificato per diversi tipi di tessuto, specie molecolari, e la strumentazione.

Introduzione

Il settore in crescita della metabolomica ha molte importanti applicazioni biologiche, tra cui la scoperta di biomarcatori, decifrando vie metaboliche nelle piante e negli altri sistemi biologici, e tossicologia profiling ^4,6-10. Una grande sfida tecnica quando si studiano i sistemi biologici è quello di studiare percorsi metabolomica senza interrompere il loro ^11. MALDI-MSI consente per l'analisi diretta dei tessuti intatti che consente il rilevamento sensibile di analiti in singoli organi ^12,13 e perfino singole cellule ^14,15.

La preparazione del campione è un passo cruciale nella produzione di immagini spettrali di massa riproducibili e affidabili. La qualità delle immagini dipende molto da fattori come il tessuto mezzo di inclusione, spessore di strato, matrice MALDI e tecnica di applicazione matrice. Per applicazioni di imaging, spessore della sezione ideale è la larghezza di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di campione). MALDI richiede deposizione di un organico, crystallinpreparato a matrice e, tipicamente un acido debole, sul campione per assistere l'ablazione analita e ionizzazione. ¹⁶ differenti matrici forniscono diverse intensità di segnale, ioni interferenti, e l'efficienza di ionizzazione di diverse classi di composti.

La tecnica di applicazione matrice gioca anche un ruolo nella qualità delle immagini di spettri di massa e tecniche diverse è adatto per diverse classi di analiti. Tre modalità applicative matrice vengono presentati in questo protocollo: aerografo, spruzzatore automatico, e la sublimazione. Applicazione matrice aerografo è stato ampiamente utilizzato nella diagnostica per immagini MALDI. Il vantaggio dell'applicazione matrice aerografo è che è relativamente semplice e veloce. Tuttavia, la qualità dell'applicazione matrice aerografo dipende fortemente dall'abilità dell'utilizzatore e tende ad essere meno riproducibile e provocare la diffusione di analiti, in particolare piccole molecole ^17. Sistemi di spruzzatore automatici devono meccanici simili a aerografo applicazione della matrice, ma have sviluppato per rimuovere la variabilità visto con applicazione aerografo manuale, rendendo lo spray più riproducibile. Questo metodo può essere a volte più in termini di tempo di applicazione matrice aerografo tradizionale. Sia aerografo manuale e sistemi di spruzzatore automatici sono metodi di applicazione della matrice a base di solventi. Sublimazione è una tecnica di applicazione matrice secca che sta diventando sempre più popolare per l'imaging spettrale di massa dei metaboliti e piccole molecole perché riduce analita diffusione, tuttavia, manca la necessaria solvente per estrarre e osservare composti massa superiore ^18.

Individuazione Fiducioso di metaboliti in genere richiede misurazioni di massa accurata avere identificazioni putativi seguiti da massa tandem (MS / MS) esperimenti di convalida con MS / MS spettri di essere rispetto agli standard, la letteratura, o spettri teorici. In questo protocollo alta risoluzione (massa potenza di 60.000 m / z 400 risoluzione), cromatografia liquida (LC)-MS è accoppiato MALDI-MSI per ottenere sia informazioni spaziali e identificazioni sicure di metaboliti endogeni, utilizzando Medicago truncatula radici e noduli radicali come il sistema biologico. Esperimenti MS / MS possono essere eseguite direttamente sul tessuto con MALDI-MSI o su estratti di tessuto con LC-MS e utilizzati per la validazione delle identificazioni dei metaboliti.

Questo protocollo fornisce un metodo semplice per mappare metaboliti endogeni in M. truncatula, che può essere adattato e applicato al MSI di piccole molecole in vari tipi di tessuto e sistemi biologici.

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Protocollo

1. Strumentazione

1. MALDI-TOF/TOF MSI. Utilizzare uno spettrometro di massa equipaggiati con una sorgente MALDI per l'analisi di piccole molecole (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Effettuare acquisizioni in modalità ione positivo o negativo a seconda degli analiti di interesse. Specificare un intervallo di massa di interesse e raccogliere 500 colpi laser / spot a 50 micron intervalli in entrambe le dimensioni X e Y attraverso la superficie del campione per generare immagini di ioni. La larghezza raster e numero di colpi laser possono essere regolati per ottenere rispettivamente maggiore risoluzione spaziale e l'intensità del segnale massimo. Utilizzare picchi matrice DHB o standard interni applicati alla slitta o direttamente al tessuto per calibrare gli spettri di massa.
2. Alta Risoluzione LC-MS. (Vedi Tabella dei materiali / attrezzature) estratti del campione eseguito con LC-MS utilizzando fase inversa (RP) LC con una colonna C-18, o fase normale (NP), con una colonna HILIC a seconda delle analiti di interesse. Usa fasi mobili esfumature come appropriati per il tipo di campione specifico. Effettuare acquisizioni in modalità ioni positivi o negativi a seconda del tipo di campione.

2. Tissue Preparazione

1. Tagliare il nodulo della radice della pianta, lasciando 3-4 mm di radice collegati al nodulo.
2. Subito dopo la dissezione, utilizzare pinze per posizionare il tessuto in una tazza criostato e coprire con gelatina (100 mg / ml in acqua deionizzata). E 'essenziale per il tessuto da attaccata al fondo della tazza con bolle d'aria.
3. Flash congelare il tessuto posizionando la coppa in un bagno di ghiaccio / etanolo secco finché la gelatina si indurisce e diventa opaca. Conservare i campioni a -80 ° C fino all'utilizzo.
4. Rimuovere i campioni dal -80 ° C freezer, tagliare via la coppa criostato plastica e tagliare via l'eccesso di gelatina. Montare il tessuto incorporato per il mandrino criostato con una monetina piccola quantità di temperatura di taglio ottimale (OCT) i media, pur non lasciando l'ottobre toccare il tessuto. Mettere in criostatobox fino a quando i solidifica ottobre.
5. Lasciare il mandrino e gelatina equilibrare nella casella criostato (insieme a -20 o -25 ° C) per circa 15 min.
6. Utilizzare il criostato (vedi TABELLA MATERIALI / Equipment) alla sezione di tessuto circa lo spessore di una cella (8-20 micron a seconda del tipo di tessuto) e disgelo montare ogni fetta sul vetro ITO rivestite riscaldando la parte posteriore (non-ITO lato) di un vetrino ITO rivestito sul dorso della mano rivestita. Posizionare il lato ITO rivestito del vetrino riscaldato vicino alla fetta di tessuto congelato e lasciare la fetta di bastone sul vetrino. Posizionamento delle sezioni vicine sulla diapositiva fornirà un migliore allineamento durante MSI.

3. Matrix Applicazione

1. Airbrush Applicazione di MALDI Matrix
   1. Tutte le procedure aerografo devono essere eseguite in una cappa aspirante.
   2. Pulire accuratamente il contenitore della soluzione aerografo e ugello (vedi Tabella dei materiali / attrezzature) con metanolo eriempire il contenitore della soluzione con soluzione di matrice DHB (150 mg / ml nel 50% methanol/0.1% TFA v / v).
   3. Tenere l'aerografo di circa 35 cm dal campione e applicare 10-15 strati di matrice sulla superficie del vetrino con una durata di 10 sec spray e 30 sec tempo di asciugatura tra ogni cappotto.
   4. Pulire accuratamente l'aerografo nuovo con metanolo al termine per evitare di intasare dalla soluzione matrice.
2. Spruzzatore automatico Applicazione di MALDI Matrix
   1. Seguire le istruzioni di start-up forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico.
   2. Per MSI di metaboliti in noduli radicali utilizzando 40 mg / ml (50% in methanol/0.1% TFA v / v) DHB come matrice, impostare la temperatura a ~ 80 ° C, velocità a 1250 mm / min, portata a 50 microlitri / min, e il numero di passaggi a 24. Per copertura ottimale, si raccomanda di ruotare l'ugello 90 ° e / o compensare l'ugello 1,5 millimetri tra ogni passata. Avviare il metodo spruzzatore.
      Come SIde nota, il particolare sistema di spruzzatore utilizzato qui riscalda l'ugello per un'evaporazione più rapida del solvente. Come solvente evapora, la concentrazione della matrice aumenta rapidamente. La matrice applicata al campione con l'aerografo e lo spruzzatore automatico hanno concentrazioni confrontabili.
   3. Seguire le istruzioni sullo spegnimento forniti dai produttori del sistema di spruzzatore automatico.
3. Sublimazione Applicazione di MALDI Matrix
   1. Pesare 300 mg DHB nella parte inferiore della camera di sublimazione (vedi Tabella dei Materiali / Equipment).
   2. Stick il vetrino al dito freddo (porzione superiore della camera di sublimazione) con le sezioni di tessuto rivolto verso il basso con biadesivo, nastro conduttivo. Coprire tutta la parte posteriore della diapositiva con il nastro biadesivo anche per conducibilità, producendo anche deposizione di matrice.
   3. Bloccare le metà superiore e inferiore della camera di sublimazione insieme al C-clamp. Collegare il vuoto e add ghiaccio e acqua fredda al serbatoio superiore.
   4. Posizionare camera di sublimazione in un mantello riscaldante che è a temperatura ambiente.
   5. Accendere la pompa a vuoto. Attendere 15 minuti e accendere il mantello di riscaldamento. Il mantello riscaldante dovrebbe raggiungere 120 ° C nel corso di 10 min.
   6. Dopo 10 min, spegnere il fuoco, chiudere la valvola a vuoto (quindi l'interno della camera rimane sotto vuoto) e spegnere la pompa a vuoto.
   7. Lasciare la camera per venire a temperatura ambiente, aprire la valvola rilasciando la pressione del vuoto e rimuovere il campione. Le dimensioni della camera di sublimazione determinerà la quantità di matrice sublimato al vetrino. Le grandi camere di sublimazione (delle dimensioni di un bicchiere da 400 ml) utilizzerà circa 300 mg di DHB mentre le camere più piccole (la dimensione di un bicchiere da 150 ml) utilizzerà circa 100 mg di DHB e richiederanno tagliare il vetrino in modo che si inserisce nella camera.

4. Acquisizione Immagine

1. Mark un modello + su ogni angolo del campione con una penna correttore liquido WiteOut per essere usato come "insegnare punti". Posizionare il vetrino nella piastra di adattamento scorrevole MALDI e prendere un'immagine ottica del campione utilizzando uno scanner.
2. Impostare un file di acquisizione immagine utilizzando il software fornito dalla società strumento con un passo raster di 50 micron e un diametro laser uguale o inferiore alla dimensione del passo raster. Su questo particolare strumento, l'impostazione minima laser spedisce un diametro laser di impostazione laser circa 10 micron e piccolo ha un diametro di 40-50 micron.
3. Caricare l'immagine ottica nel software e allineare la piastra con l'immagine ottica.
4. Calibrare lo strumento prima di iniziare l'acquisizione utilizzando ioni comuni matrici di cluster, standard interni, o un mix di calibrazione.
5. Specificano le aree di tessuto da analizzare con MSI, compreso un punto di pura matrice sul vetrino per essere utilizzato come "bianco".
6. Inizia acquisizione.

5. Generazione Immagine

1. Aprire il file di immagini nel software disponibile in commercio fornito dal venditore e estrarre le immagini di ioni. Altri software open-source è disponibile per MSI elaborazione dei dati ^19.

6. Identificazione di Metaboliti

1. Selezionare uno specifico m / z di interesse da parte lo spettro di massa utilizzando il software specifico del fornitore (vedi Tabella dei Materiali / Equipment). Un analita può essere distinto da uno ione matrice quando un picco analita viene scelto dal spettro di massa e immagini ioni sono generati specificamente localizzata nella sezione di tessuto.
2. Generare un elenco di analiti di interesse e di effettuare esperimenti di MS / MS. Vedi Tabella 1 e Tabella 2 Risultati rappresentativi per le liste di campionamento di analiti.
3. Eseguire mirata analisi LC-MS su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione (o alta risoluzione MALDI-MS se disponibile) per ottenere accuratemisure di massa degli analiti di interesse e anche effettuare LC-MS/MS degli analiti bersaglio per ottenere modelli caratteristici di frammentazione.
4. Eseguire database di ricerca per determinare le identificazioni putativi per gli analiti mirati. Esempi di database metaboliti comprendono: METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG, e HMDB.
5. Per confermare le identificazioni putativi di accurata ricerca nei database di massa, far corrispondere la MS / MS da parte degli analiti mirati per MS / MS spettri di standard, letteratura, e / o software di previsione frammentazione.

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Risultati

Una panoramica sperimentale di MSI è mostrato in Figura 1. All'inizio dell'esperimento, preparazione del campione è un passaggio fondamentale. I noduli vengono tagliati dalla radice vegetale e incorporati in gelatina. Il tessuto deve essere appiattita contro la tazza criostato, in assenza di bolle, mentre viene congelato; questo garantirà allineamento facile e corretto del tessuto mentre viene sezionato. Quando il tessuto viene affettato, è importante tagliare il tessuto allo spessore adegua...

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Discussione

Come discusso sopra, la preparazione del campione è la fase più critica del flusso di lavoro MSI. Incorporare il tessuto non uniforme causerà sezionamento essere difficile o impossibile in alcuni casi. La dimensione del vano e adeguato tempo di equilibrio sono cruciali per mantenere l'integrità dei tessuti ed evitando piegatura e lacrime. Selezione di matrice e tecnica di applicazione giocherà un ruolo nella determinazione dei tipi di analiti da rilevare, la risoluzione spaziale, e la riproducibilità dei risul...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Difco	214340	heat to dissolve
Cryostat- HM 550	Thermo Scientific	956564A
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides	Delta Technologies	CB-90IN-S107	25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix	ICN Biomedicals	PI90033
Airbrush	Paasche Airbrush Company	TG-100D	coupled with 75 ml steel container
Automatic matrix sprayer system- TM-Sprayer	HTX Technologies, LLC	HTX.TMSP.H021-U	Specific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed
Sublimation apparatus	Chemglass Life Science	CG-3038-01
Vaccum pump- Alcatel 2008 A	Ideal Vacuum Products	P10976	Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF	Bruker Daltonics	276601
FlexImaging	Bruker Daltonics	269841	One example of "vender specific software"
MALDI LTQ Orbitrap	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMASZ	High resolution MALDI instrument for accurate mass measurements
Q Exactive	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	High resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements