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요약

질량 분석 영상 (MSI)은 생물 학적 과정에 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 자신의 네이티브 환경에서 화합물을 보존, 그대로 조직에서 다양한 화학 종을 발견하고 식별하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서 작은 분자의 분석을 위해 개발 MSI 방법이 설명된다.

초록

이러한 의약품 또는 내인성 대사와 같은 작은 분자를 연구 잠재적으로 1 연구되고 대사 경로에 변화를 일으킬 수있는 그 조직의 균질화를 필요로 조직 추출물을 사용하는 데 사용되는 대부분의 기술. 질량 분석 영상 (MSI)은 생체 조직 샘플 1-5의 손상 조각 내 분석의 공간 정보를 제공 할 수있는 강력한 분석 도구입니다. 이 기술은 단백질, 펩티드, 지질과 같은 내인성 대사와 같은 작은 분자를 포함하여 각종 화합물을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MSI와, 다 대사 산물의 공간적 분포를 동시에 검출 할 수있다. 여기서, 콩과의 식물 뿌리와 뿌리혹에 타겟이 불분명 한 대사 MSI의 실험을 위해 특별히 개발 된 방법이 일어나는 생물학적 과정에 대한 통찰력을 표시 할 수있는 표시됩니다.여기에 제시된 방법은 시료 준비에서 이미지 수집으로, 일반적인 MSI의 흐름을 보여주고, 작은 분자를 검출하는 데 도움이되는 여러 매트릭스 응용 프로그램 기술을 시연, 매트릭스 응용 프로그램 단계에 초점을 맞추고 있습니다. MS의 이미지가 생성되면, 그 대사 산물의 분석 및 식별을 논의 보여줍니다. 여기에 제시된 표준 워크 플로우를 쉽게 다른 조직 유형, 분자 종, 및 계측에 대해 수정할 수 있습니다.

서문

대사의 성장 분야는 바이오 마커 발견, 식물과 다른 생물 학적 시스템에 대사 경로를 해독하고, 독성 프로파일 4,6-10 등 많은 중요한 생물 학적 응용 프로그램을하고 있습니다. 시스템 생물학을 공부하고 주요 기술 과제는 그들에게 11을 방해하지 않고 메타 볼로 경로를 연구하는 것입니다. MALDI-MSI는 단일 기관 12, 13, 심지어 하나의 세포 (14, 15)에 분석의 민감한 탐지를 가능하게 손상 조직을 직접 분석 할 수 있습니다.

샘플 준비를 재현하고 신뢰할 수있는 질량 스펙트럼 이미지를 생산하는 중요한 단계입니다. 이미지의 품질이 크게 티슈 매립 매체, 슬라이스 두께, MALDI 매트릭스 및 매트릭스 응용 기술과 같은 요인에 의존한다. 이미징 애플리케이션에 이상적인 단면 두께는 하나의 셀 (시료 유형에 따라 8-20 μM)의 폭이다. MALDI 유기, crystallin의 증착을 필요로E 매트릭스 화합물, 분석 절제 및 이온화를 돕기 위해 샘플에 전형적 약산. 16 다른 행렬들은 상이한 신호 강도, 간섭 이온 및 화합물의 다른 클래스의 이온화 효율을 제공한다.

매트릭스 응용 기술은 또한 질량 스펙트럼 이미지 및 다른 기술의 품질 역할 분석의 다른 클래스에 적합한한다. 세 매트릭스 응용 프로그램의 방법은이 프로토콜에 제시되어있다 : 에어 브러쉬, 자동 분무기, 승화. 에어 브러시 매트릭스 애플리케이션은 광범위 MALDI 이미징에 사용되어왔다. 에어 브러쉬 매트릭스 애플리케이션의 장점은 상대적으로 신속하고 용이하다는 것이다. 그러나, 에어 브러쉬 매트릭스 애플리케이션의 품질은 크게 사용자의 숙련도에 따라 덜 재현 할과 분석 물질의 확산, 특히 작은 분자 (17)을 야기하는 경향이있다. 자동 스프레이 시스템은 매트릭스 애플리케이션 에어 브러시 유사한 기계가 있지만, 근래전자 스프레이 더 재현하고, 수동 에어 브러쉬 응용 프로그램을 볼 수있는 변동성을 제거하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 때로는 더 많은 시간이 소요되는 기존의 에어 브러쉬 매트릭스 응용 프로그램을보다가 될 수 있습니다. 수동 에어 브러쉬 자동 스프레이 시스템은 모두 솔벤트 기반의 매트릭스 응용 프로그램의 방법이다. 그러나, 추출 및 높은 질량 화합물 (18)을 관찰하기 위해 용매 필요한 부족, 승화는 분석 확산을 줄일 수 있기 때문에 대사와 작은 분자의 질량 스펙트럼 이미징 점점 더 인기를 끌고있다 건조 매트릭스 응용 기술이다.

대사의 신분은 일반적으로 탠덤 질량 MS / MS 스펙트럼이 표준, 문학, 또는 이론적 스펙트럼에 비교되는 유효성 검사에 대한 (MS / MS) 실험, 다음 추정 동정을 얻기 위해 정확한 질량 측정이 필요합니다. 이 프로토콜 고해상도 (질량 m / z 400에서 60,000의 분해능), 액체 크로마토 그래피 (LC)-MS는 개자리는 생물학적 시스템으로 뿌리와 뿌리혹을 truncatula 사용하여, 공간 정보 및 내인성 대사의 자신감을 식별 모두를 얻기 위해 MALDI-MSI에 연결된다. MS / MS 실험은 MALDI-MSI 또는 LC-MS와 조직 추출물의 조직에서 직접 수행 및 대사 산물 식별의 유효성 검사에 사용 할 수 있습니다.

이 프로토콜은 M. 내인성 대사를 매핑 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다 적응 및 다양한 조직 유형 및 생물학적 시스템에서 작은 분자 MSI에 적용될 수 truncatula.

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프로토콜

1. 수단

  1. MALDI-TOF/TOF MSI. 작은 분자의 분석을위한 MALDI 소스가 장착 된 질량 분석기를 (재료 / 장비의 표 참조)를 사용합니다. 그 분석에 따라 양 또는 음 이온 모드에서 획득을 수행합니다. 관심의 질량 범위를 지정하고 이온의 이미지를 생성하는 샘플의 표면을 가로 질러 x와 y 차원 모두에서 50 ㎛ 간격으로 500 레이저 샷 / 자리를 수집합니다. 레이저 샷의 래스터 폭과 번호는, 각각 더 높은 공간 분해능 및 최대 신호 강도를 얻기 위해 조정될 수있다. DHB 매트릭스 피크 또는 질량 스펙트럼을 보정 슬라이드에 직접 조직에 적용되는 내부 기준을 사용합니다.
  2. 높은 해상도 LC-MS. (재료 / 장비의 표 참조) LC-MS는 HILIC 열이 관심의 분석에 따라와 C-18 열, 또는 정상적인 단계 (NP)과 역상 (RP) LC를 사용하여 실행 샘플을 추출. 이동상 및 사용특정 샘플 유형에 대한 적절한 그라디언트. 시료의 유형에 따라 양 또는 음 이온 모드에서 획득을 수행한다.

2. 조직 준비

  1. 결절에 부착 된 루트 3 ~ 4 밀리미터를두고, 공장에서 루트 결절 트림.
  2. 즉시 절개 한 후, 저온 유지 컵에 조직을두고 젤라틴 (탈 이온수에서 100 ㎎ / ㎖)를 충당하기 위해 집게를 사용합니다. 조직이 기포와 컵의 바닥에 붙어되는 것이 필수적이다.
  3. 플래시 젤라틴 견고 불투명해질 때까지 드라이 아이스 / 에탄올 욕에 컵을 배치하여 조직을 동결. -80 ° C까지 사용에서 보관 샘플.
  4. 에서 샘플을 제거 -80 C 냉장고 °, 플라스틱 저온 유지 컵을 버려야 과잉 젤라틴을 멀리 트림. OCT를 사용하여 조직을 터치 두지 않을 동안, 최적의 절삭 온도 (10 월) 미디어 한푼 크기의 양의 저온 유지 척에 포함 된 조직을 설치합니다. 저온 유지 장치에 배치OCT를 응고 될 때까지 상자.
  5. 척 젤라틴은 약 15 분 동안 (-20 또는 -25 ° C에서 세트) 저온 유지 장치 상자에서 평형을 허용합니다.
  6. 백 (비 ITO를 따뜻하게하여 ITO 코팅 유리에 각 슬라이스를 마운트 그라 이오 스탯 (재료 / 장비의 표 참조) 섹션 조직에 약 하나의 셀의 두께 (8-20 μm의는 조직의 유형에 따라)과 해동을 사용하여 손등에 ITO 코팅 유리 슬라이드의면) 코팅. 냉동 조직 절편 근처 따뜻하게 슬라이드의 ITO 코팅면을 놓고 슬라이스가 슬라이드에 충실 할 수 있습니다. 슬라이드에 가깝게 섹션을 배치하는 MSI 동안 더 나은 정렬을 제공 할 것입니다.

3. 매트릭스 응용 프로그램

  1. MALDI 매트릭스의 에어 브러시 적용
    1. 모든 에어 브러쉬 절차는 흄 후드에서 수행해야합니다.
    2. 철저히 에어 브러쉬 솔루션 컨테이너와 노즐 (재료 / 장비의 표 참조) 메탄올을 청소하고DHB 매트릭스 용액으로 용액 용기를 채우기 (50 % methanol/0.1 %의 TFA의 V에서 150 ㎎ / ㎖ / v).
    3. 약 35 센티미터 샘플에서 에어 브러쉬를 잡고 10 초 스프레이 기간 및 각 코트 사이에 30 초 건조 시간과 슬라이드의 표면에 매트릭스의 10-15 코트를 적용합니다.
    4. 매트릭스 솔루션에서 막힘 방지하기 위해 완료되면 철저하게 메탄올로 다시 에어 브러시를 청소합니다.
  2. MALDI 매트릭스의 자동 스프레이 응용 프로그램
    1. 자동 스프레이 시스템의 제조 업체에서 제공하는 스타트 업 지침을 따르십시오.
    2. 40 ㎎ / ㎖를 사용하여 루트 결절의 대사 산물의 MSI (50 % methanol/0.1 %의 TFA의 V IN / V) DHB 매트릭스 ~ 80 ° C, 속도에 1천2백50mm / 분, 50 유량에 온도 설정을위한 μL / 분, 24에 패스의 수. 최고의 보험의 경우,이 노즐 90 ° 및 / 또는 각 패스의 노즐 1.5 mm 오프셋을 회전하는 것이 좋습니다. 스프레이 방법을 시작합니다.
      SI로데주의, 여기에 사용 된 특정 스프레이 시스템은 용매의 빠른 증발을 위해 노즐을 가열한다. 용매가 증발 할 때, 매트릭스의 농도는 빠르게 증가한다. 에어 브러시와 자동 분무기를 이용하여 시료에 적용되는 매트릭스는 비교 농도가있다.
    3. 자동 스프레이 시스템의 제조 업체에서 제공하는 셧다운 지시 사항을 따르십시오.
  3. MALDI 매트릭스의 승화 신청
    1. (재료 / 장비의 표 참조) 승화 실의 바닥에 300 밀리그램의 DHB를 달다.
    2. 조직 섹션 양면, 전도성 테이프를 아래로 향하게하여 차가운 손가락 (승화 챔버의 상부)에 유리 슬라이드 스틱. 심지어 매트릭스 증착을 생산, 심지어 전도성 양면 테이프와 슬라이드의 뒷면 전체를 커버.
    3. 함께 C-클램프로 승화 챔버의 상하 반쪽 클램프. 진공 및 광고를 연결상부 저수지에 D 얼음과 차가운 물.
    4. 실내 온도에 가열 맨틀에서 승화 챔버를 놓습니다.
    5. 진공 펌프의 전원을 켭니다. 15 분을 기다린 후 가열 맨틀의 전원을 켭니다. 가열 맨틀은 10 분에 걸쳐 120 ° C에 도달해야합니다.
    6. 10 분 후, 열, 진공 개폐 밸브 (그래서 챔버의 내부는 진공 상태 유지)를 해제하고 진공 펌프를 끄십시오.
    7. 진공 압력 방출 밸브를 열고 샘플을 제거, 챔버는 실내 온도에 올 수 있습니다. 승화 챔버의 크기가 유리 슬라이드에 승화 행렬의 양을 결정할 것이다. 작은 챔버 (150 ㎖의 비이커의 사이즈) DHB 약 100 밀리그램을 사용하고 유리 슬라이드를 절단 필요하면서 큰 승화 챔버 (400 ㎖의 비이커의 사이즈) DHB 약 300 mg의 사용되도록 그것을 챔버에 맞는.

4. 이미지 획득

    <리> 마크 "가르쳐 포인트」로서 사용되는 WiteOut 수정액 펜으로 샘플의 각 모서리에 + 패턴. MALDI 슬라이드 어댑터 플레이트에 유리 슬라이드를 삽입하고 스캐너를 사용하여 샘​​플의 광학 이미지를 촬영.
  1. 50 ㎛의 래스터 스텝 사이즈와 같거나 래스터 스텝 사이즈보다 작은 레이저 직경 인스트루먼트 사에 의해 제공된 소프트웨어를 사용하여 화상 취득 파일을 설정. 이 특정 기기에서 최소 레이저 설정은 40 ~ 50 μm의 직경이 약 10 μm의 작은 레이저 설정의 레이저 직경을 제공합니다.
  2. 소프트웨어에 광학 이미지를로드하고 광학 이미지로 판을 맞 춥니 다.
  3. 일반적인 매트릭스 클러스터 이온, 내부 표준 또는 교정 믹스를 사용하여 인수를 시작하기 전에 악기를 보정합니다.
  4. "빈"으로 사용될 슬라이드 순수 행렬의 스폿 등으로 MSI 분석 할 조직의 영역을 지정한다.
  5. 교류 시작quisition.

5. 이미지 생성

  1. 공급 업체에서 제공하는 상용 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 이온 이미지를 추출합니다. 다른 오픈 소스 소프트웨어는 MSI 데이터 처리 19 사용할 수 있습니다.

6. 대사 산물 식별

  1. 공급 업체에 특정 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼에서 관심의 특정 M / Z를 (재료 / 장비의 표를 참조). 분석 물 피크가 질량 스펙트럼으로부터 선택되는 이온 이미지가 구체적으로 조직 절편에 국부적으로 생성 될 때 분석 물은 매트릭스 이온 구별 될 수있다.
  2. 그 분석의 목록을 생성 및 MS / MS 실험을 수행합니다. 분석의 샘플 목록의 대표 결과 표 1과 표 2를 참조하십시오.
  3. 정확한을 얻기 위해 (또는 가능하면 높은 해상도 MALDI-MS) 고해상도 질량 분석기에 표적으로 한 LC-MS 분석을 수행대중의 관심의 분석의 측정과도 특성 조각 패턴을 얻기 위해 분석 대상 물질의 LC-MS/MS를 수행합니다.
  4. 대상 분석을위한 추정 식별을 결정하는 검색 데이터베이스를 수행합니다. 대사 데이터베이스의 예는 다음과 같습니다 METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG 및 HMDB을.
  5. 정확한 질량 데이터베이스 검색에서 추정 식별을 확인하기 위해, 표준, 문학, 및 / 또는 분열 예측 소프트웨어의 MS / MS 스펙트럼을 분석 대상에서 MS / MS를 일치합니다.

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결과

MSI의 실험 개요는도 1에 도시된다. 실험의 시작에서, 샘플 준비는 중요한 단계입니다. 결절은 식물 뿌리에서 트리밍 된 젤라틴에 포함됩니다. 이 동결되는 동안 조직은, 아니 거품, 저온 유지 컵에 평평하게 눌러야합니다, 그것은 단면되는 동안이 조직의 쉽고 적절한 정렬을 보장합니다. 조직과 분리 될 때, 적절한 두께로 조직을 절단하기 위해 중요하다; 섹션 너무 두껍게 추출 및 조?...

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토론

전술 한 바와 같이, 샘플 준비는 MSI 흐름에서 가장 중요한 단계이다. 고르지 조직을 포함하면 경우에 가능 어렵거나없는 것으로 절편의 원인이됩니다. 단면의 크기 및 적절한 평형 시간은 조직의 무결성을 유지하고 접는 눈물 회피에 결정적이다. 행렬 및 응용 기술의 선택은 검출 될 분석 물의 유형을 결정하는 역할, 공간 해상도, 및 결과의 재현성을 할 것이다. 행렬 또는 적용 기술의 조합을 사?...

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공개

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 말

저자는 개자리의 truncatula 샘플을 제공하는 UW-매디슨에서 농업 경제학학과 박사 장 미셸 ANE을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF)의 자금에 의해 부분적으로 지원 된 보조금 CHE-0957784, 위스콘신 대학의 대학원 위스콘신 동문회 연구 재단 (WARF) 및 Romnes 교직원 연구 활동 프로그램 (LL까지). EG는 NSF 대학원 연구 활동 (DGE-1256259)를 인정한다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
GelatinDifco214340heat to dissolve
Cryostat- HM 550Thermo Scientific956564A
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix ICN BiomedicalsPI90033
AirbrushPaasche Airbrush CompanyTG-100Dcoupled with 75 ml steel container
Automatic matrix sprayer system- TM-SprayerHTX Technologies, LLCHTX.TMSP.H021-USpecific start-up and shut-down instructions will be given when the instrument is installed
Sublimation apparatus Chemglass Life ScienceCG-3038-01
Vaccum pump- Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976Ultimate Pressure = 1 x 10-4 Torr
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics276601
FlexImagingBruker Daltonics269841One example of "vender specific software"
MALDI LTQ OrbitrapThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMASZHigh resolution MALDI instrument for accurate mass measurements
Q ExactiveThermo ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRHigh resolution LC-MS instrument for accurate mass measurements

참고문헌

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