Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen mikrofluidischen Biochip-basierten elektrochemischen DNA-Hybridisierung für Erkennung. Folgende ssDNA-Sonde Funktionalisierung werden die Spezifität, Empfindlichkeit und Nachweisgrenze mit komplementären und nicht-komplementären ssDNA Ziele untersucht. Ergebnisse veranschaulichen den Einfluss der DNA-Hybridisierungsereignisse auf dem elektrochemischen System, mit einer Nachweisgrenze von 3,8 nM.

Zusammenfassung

Miniaturisierung von analytischen Laborbedingungen in den Mikromaßstab bietet erhebliche Vorteile in Bezug auf die Reaktionszeit, der Kosten und der Integration von Vorverarbeitungsschritte. Verwendung dieser Vorrichtungen zur Analyse von DNA-Hybridisierungsereignisse ist wichtig, weil es eine Technologie zur Echtzeit-Beurteilung von Biomarkern am Point-of-Care für verschiedene Krankheiten. Wenn die Vorrichtung Grundfläche verringert jedoch die Dominanz der verschiedenen physikalischen Erscheinungen zu. Diese Phänomene beeinflussen die Fertigungsgenauigkeit und Betriebssicherheit der Vorrichtung. Daher besteht ein großer Bedarf zur genauen Herstellung und Betrieb dieser Geräte in einer reproduzierbaren Weise, um die Gesamtleistung zu verbessern. Hier beschreiben wir die Protokolle und die für die Herstellung und den Betrieb eines Mikrofluidbasis elektro Biochips für die genaue Analyse von DNA-Hybridisierungsereignissen Methoden. Der Biochip besteht aus zwei Teilen: einem Mikrofluid-Chip mitdrei parallele Mikrokanäle aus Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt, und ein 3 x 3 Feld aus elektrochemischen Mikrochip. Die DNA-Hybridisierungsereignisse werden durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS)-Analyse nachgewiesen. Die EIS-Analyse ermöglicht die Überwachung Variationen der Eigenschaften des elektrochemischen Systems, das dominant in diesen Längenskalen sind. Mit der Fähigkeit, Änderungen sowohl Ladungstransfer und Diffusionswiderstand mit dem Biosensor zu überwachen, die Selektivität für komplementäre ssDNA Ziele, eine berechnete Nachweisgrenze von 3,8 nm und eine 13% Kreuzreaktivität mit anderen, nicht-komplementäre ssDNA folgenden 20 min zeigen wir, Inkubation. Diese Methode kann die Leistung von miniaturisierten Geräten durch die Aufklärung über das Verhalten der Diffusion auf der Mikroskala Regime und durch Aktivieren der Untersuchung von DNA-Hybridisierungsereignissen zu verbessern.

Einleitung

Mikrofluidischen Lab-on-a-Chip (LOC)-Geräte bieten zahlreiche Vorteile in der klinischen Diagnostik, der Umweltüberwachung und der biomedizinischen Forschung. Diese Vorrichtungen verwenden mikrofluidische Kanäle, um eine Fluidströmung zu Bereichen des Chips, wo eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Mischen Reagens, bezogen Affinität bindende, Signaltransduktion und der Zellkulti ^1-4 erfolgen steuern. Mikrofluidik bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen klinischen Diagnosewerkzeuge wie Mikrotiterplatte Leser oder Elektrophorese-Gel-Shift-Assays. Mikrofluidik-Vorrichtungen erfordern 2 bis 3 Grßenordnungen (Nanolitern, im Gegensatz zu Mikroliter) weniger Reagenzien ähnliche Tests durchzuführen. Auch können diese Geräte die Geschwindigkeit, mit der einige biologische Ereignisse aufgrund der kleineren Haft der Arten innerhalb der Kanäle ^5,6 zu erhöhen. Drittens können Sensoren in Mikrofluidikeinheiten mittels Lithographie und Ätzverfahren, die markierungsfreie Erken bieten können integriert werdenn. Schließlich sind diese Vorrichtungen kostengünstig in der Herstellung und erfordern wenig Aufwand seitens des Technikers zu bedienen ^7-10.

Markierungsfreien Detektion wird typischerweise unter Verwendung eines optischen oder elektrischen Wandlers. Optische Vorrichtungen besser Sensorleistung aufgrund der geringeren Beeinträchtigung Analyten in der Probe vorliegt. Dennoch ist ihre Leistung in Fällen, in denen die Proben Hintergrund die gleiche Resonanzwellenlänge als Sensor ¹¹ beeinträchtigt werden. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von elektrischen Signalen, um biologische und chemische Nachweis in mikrofluidischen Systemen durchzuführen. Die Herstellung von sich aus weniger kompliziert, da diese Sensoren in der Regel nur erforderlich strukturierten Elektroden zu bedienen. Zusätzlich können elektrische Signale direkt mit den meisten Messvorrichtung verbunden werden, während eine andere Signal Modalitäten kann ein Wandler erforderlich, um das Signal umzuwandeln ^12-15. Elektrische Sensoren häufig Veränderungen in impedanc messenE ^16,17, Kapazität ^{18, 19} oder Redox-Aktivität. Allerdings werden vor neue Herausforderungen gestellt, wie diese Systeme miniaturisiert werden. Die wichtigsten Herausforderungen zu meistern sind: Probenvorbereitung und Mischen von Flüssigkeiten (aufgrund der geringen Probenvolumen und Reynolds-Zahl), physikalische und chemische Effekte (einschließlich Kapillarkräfte, Oberflächenrauhigkeit, chemische Wechselwirkungen zwischen Baumaterialien und Analyten), niedrige signal Rausch-Verhältnis ^20-23 und mögliche Interferenz von elektroaktiven Analyten in komplexen biologischen Proben (zB Blut und Speichel) (durch die verringerte Oberfläche und Volumen) gemessen. Weitere Untersuchungen dieser Effekte wird Richtlinien für eine genaue Fertigung und des Betriebs dieser Geräte in einer reproduzierbaren Art und Weise, auf die Gesamtleistung verbessern würde.

DNA-Hybridisierungsdetektion wird weitgehend verwendet, um genetische Erkrankungen ^24,25 und verschiedene Formen von Canc diagnostizierenER ^26. Jedes Jahr werden mehrere Stämme der Influenza bei Patienten, die Ergebnisse von DNA-Hybridisierungstechniken ²⁷ identifiziert. Das Influenza-Virus allein entfallen 36.000 Todesfälle pro Jahr in den Vereinigten Staaten ^28. Solche Beispiele könnten von einer Tisch-Mikrofluid-Vorrichtung, die die gleichen Testverfahren wie einem Plattenleser oder ein Gel-Shift-Assay mit geringen Probenvolumen und zu einem Bruchteil der Kosten, ohne die Empfindlichkeit oder Spezifität führen kann profitieren. Aufgrund der vielen Vorteile der markierungsfreien elektrochemischen Sensor, es wurde ausgiebig für den Nachweis von DNA-Hybridisierungsereignissen ^29,30 verwendet. Ein Setup, wo Makro-Skala Elektroden (im Millimeterbereich) in Bechergläser mit der Lösung von Interesse getaucht werden können, verwendet werden, um sehr sensible Daten über die Bindung Kinetik von Einzelstrang-DNA-Sequenzen auf ihre passenden komplementären Sequenzen liefern. Kürzlich gab es ein paar Fortschritte bei der Einbeziehung elektrochemischen Mess in MICRofluidics für die DNA-Hybridisierung. Es wurden Studien durchgeführt über Hybridisierungskinetik ³¹ und Integration von Sensoren für die Erkennung ¹⁵ in mikrofluidischen Kanälen. Allerdings gibt es immer noch einen Bedarf für eine schnelle Hochdurchsatz-Mikrofluid-Gerät, das DNA-Hybridisierungsereignisse parallel analysieren kann, ohne komplizierte Probenvorbereitungsschritte.

Die in dieser Arbeit vorgestellten Vorrichtung ist eine Plattform, die mehrere Wechselwirkungen, die parallel und ohne aufwendige Probenvorbereitungsschritte durchmustert werden können. Unser Protokoll zeigt, wie Mikrofluidik-basierten elektrochemische Biochips sind mit mikroelektromechanische Systeme (MEMS)-Technologie ^32,33 mikrofabriziert. Wir beschreiben den Herstellungsprozeß sowohl des mikrofluidischen Chips von Polydimethylsiloxan (PDMS) und die elektrochemische Chip, der eine Anordnung von Elektroden umfasst. Die chemische Funktionalisierung des Biochips mit ssDNA-Sonden wird ebenfalls angesprochen. Schließlich wird die Abilkeit des Biosensors speziell zu erkennen und zu analysieren, ssDNA Ziele demonstriert. Insgesamt ist die mikrofluidische Basis elektro Biochip eine schnelle und hohe Durchsatzanalyse-Technik. Es kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen und Durchführung Wandler zu untersuchen, und können in einer Vielzahl von Lab-on-a-Chip-Anwendungen verwendet werden.

Protokoll

1. Mikrofabrikation des mikrofluidischen Chips

1. Bereiten Elektrochemische Chip
   1. Muster Goldelektroden
      1. Spülen Sie ein leeres 4 '' Silizium-Wafer (Grade-Qualität prime) mit Aceton, Methanol und Isopropanol ("AMI" sauber). Spülen Sie das Isopropanol aus dem Wafer mit deionisiertem Wasser (DI), gefolgt von Trocknen mit N ₂ Pistole.
      2. Wachsen eine 1 um dicke SiO _{2-Passivierungsschicht} mit plasmaunterstützte chemische Gasphasenabscheidung (PECVD)-Tool. Zahlen Sie 200 Å dicke Schicht aus Chrom, gefolgt von einer 2000 Å dicken Schicht aus Gold mit einem DC-Sputtern Werkzeug.
      3. Spin "PR1" positive Photoresist (Spinnparameter: 3000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s), um gleichmäßigen Film ~ 1,6 um dick zu erstellen. Pre-Bake-Wafers für 1 min bei 100 ° C auf einer heißen Platte.
      4. Aussetzen des Wafers mit 190 mJ / cm ² bei 405 nm durch eine Photomaske. Entwickeln Sie die Wafer für 30 Sekunden in 352 Entwicklereloper und spülen Sie die Wafer mit DI und trocken mit N ₂ Pistole.
      5. Ätzen der Gold mit Ätzmittel für 1,5 min. Ätzen der Chrom mit Chrom Ätzmittel für ~ 30 sek. Spülen des Wafers mit DI und trocken mit N ₂ Pistole.
      6. Streifen der Photolack mit "AMI" saubere Verfahren.
         HINWEIS: starkes Oxidationsmittel und potenziell explosiv.
      7. Reinigen des Wafers mit 4: 1 H ₂ SO _4: H ₂ O _2-Gemisch ("Piranha" clean) für 1 min. Spülen des Wafers mit DI und trocken mit N ₂ Pistole.
   2. Muster Platinelektroden
      1. Spin "PR2" positive Photoresist (Spinnparameter: 3000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s), um gleichmäßigen Film ~ 1,4 um dick zu erstellen. Pre-Bake-Wafers für 1 min bei 100 ° C auf einer heißen Platte.
      2. Aussetzen des Wafers mit 30 mJ / cm ² bei 405 nm durch eine Photomaske. Backen Sie die Wafer für 45 Sekunden bei 125 ° C auf einer heißen Platte. Hochwasser aussetzender Wafer mit 1.000 mJ / cm ² bei 405 nm Wellenlänge ohne eine Photomaske. Entwickeln Sie die Wafer für 2 min in 6: 1 AZ400K Entwickler und spülen Sie die Wafer mit DI und trocken mit N ₂ Pistole.
      3. Zahlen Sie 400 Å dicke Schicht aus Titan, gefolgt von einer 1600 Å dicken Schicht aus Platin mit einem Elektronenstrahl-Verdampfungssystem.
      4. Abheben Photoresist in einem Acetonbad ultraschall für 5 Minuten, gefolgt von Spülen mit Aceton und Isopropanol. Spülen des Wafers mit DI und trocken mit N ₂ Pistole.
2. Bereiten Assay Kanäle
   1. Bereiten Form für Assay-Kanäle
      1. Spülen Sie ein leeres 4 '' Silizium-Wafer (Test-Grade-Qualität) mit "AMI" saubere Verfahren. Spülen Sie das Isopropanol aus dem Wafer mit DI, gefolgt von Trocknen mit N ₂ Pistole.
      2. Spin "PR3" negative Photolack (2-Schritt-Spinnparameter:. Schritt eins - 600 min, 120 U / sec, 10 sec Schritt zwei - 1.150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) zu einheitlichen Film ~ 100 um dick zu erstellen. Pre-Bake-Wafers auf einer heißen Platte (2-Schritt-Backparameter:. Schritt eins - Rampe von Raumtemperatur bis 65 ° C bei 300 ° C / h, die Temperatur für 10 min Schritt 2 - Rampe bis zu 95 ° C bei 300 ° C / h, die Temperatur 30 min).
      3. Aussetzen des Wafers mit 2500 mJ / cm ² bei 405 nm durch eine Photomaske. Post-Bake-Wafers durch Rampen bis zu 95 ° C bei 300 ° C / h, die Temperatur für 10 min auf einer heißen Platte. Entwickeln Sie die Wafer für 10 min in Propylenglykolmonomethyletheracetat (PGMEA) Entwickler. Spülen Sie die Wafer mit Isopropanol reinigen und mit N ₂ Pistole.
   2. Herzustellen Assay Kanäle
      1. Herstellung von 10: 1 Polydimethylsiloxan (PDMS)-Gemisch (20 g Elastomer, 2 g Härter) und vollständig entgasen in einer Vakuumkammer für 20 min.
      2. Definieren Sie ein Gehäuse um die Form-Wafer mit Aluminiumfolie und gießen Sie langsam das nicht ausgehärtete PDMSüber die Form.
      3. Backen Sie die Form mit den PDMS in einem Kammerofen (2-Schritt-Backparameter:. Schritt eins - 5 min Rampe von Raumtemperatur bis 80 ° C Schritt 2 - halten bei 80 ° C für 17 min).
      4. Abziehen der PDMS von der Form nehmen und auf Aluminiumfolie. Schneiden Sie die Test-Chips mit einem Chirurgen Messer, definieren Löcher mit einer Biopsie-Stanzwerkzeug.

2. Bauen Sie die Geräte-

1. Manuell ausrichten PDMS-Assay-Kanäle mit den Arbeitselektroden auf die elektrochemische Chip. PDMS haftet gut auf die elektrochemische Chip, Abdichten der Kanäle und verhindert Leckagen.
2. Schließen Sie einen flexiblen Schlauch (OD 0,087 'und 0,015 ID' '), um ein Kunststoff Ellenbogen oder gerader Stecker mit einem kurzen flexiblen Schlauch als Adapter (OD 0,1875' 'und 0,0625 ID' '). Befestigen Anschlüsse an jede der gelochten Einlässe in das Gerät.
3. Eine Spritze am anderen Endedie Schläuche und legen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe. Alternativ kann die Menge von einer Spritze, einem Rohr und einem Verbinder gemß der erforderlichen Verfahrensschritt in Abschnitt 3 und der entsprechenden Lösung zu ändern.

3. Analysieren DNA-Hybridisierung

HINWEIS: Führen jedes Lösung langsam in den Kanal bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ul / h bis der gesamte Kanal gefüllt.

1. Funktionalisieren jede vertikale Mikrokanal mit einer anderen ssDNA Sondensequenz (zuführen parallel zu den 3 separate vertikale Mikro):
   1. In jede Mikrokanal mit einer anderen ssDNA-Sonde inkubiert Lösung (10 mM Phosphatpuffer, 100 mM NaCl, 10 uM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) und 1 uM Sonde ssDNA), und Inkubation für 1 h, gefolgt von Spülen der Mikrokanal mit PBS.
   2. Füllen des Mikrokanals mit einer Lösung, enthaltend 1 mM 6-Mercapto-1-hexanol (MCH) in einem Puffer aus 10 mM PBS, 100 mM NaCl und 1,395 mM TCEP und incuBeize für 1 h, gefolgt von Spülen der Mikrokanal mit PBS.
2. Heben Sie die PDMS, um 90 ° in eine horizontale Ausrichtung, und legen bis zu getrennten Reihen von Reaktionskammern mit jeder Zeile mit einer eindeutigen Zähler und Referenzelektrode (Abbildung S1) aus.
3. Füllen Sie die Mikrokanäle mit Steuermesslösung von 4x konzentrierte Salz-Natriumcitrat (SSC)-Puffer und Inkubation für 20 min.
4. Hintergrundmessung: Füllen Sie die Mikrokanäle mit 5 mM Ferricyanid / 5 mM Ferrocyanid in PBS-Lösung und notieren Sie die Impedanzwerte der elektrochemischen System für verschiedene Frequenzen (elektrochemische Impedanzspektroskopie, EIS) mit Hilfe eines Potentiostaten an die Arbeits, Zähler verbunden und Referenzelektroden ( EIS-Parameter: Frequenzbereich von 1 MHz bis 0,1 Hz, 10 Frequenzdatenpunkte pro Jahrzehnt, 25 mV Amplitude, 5 mV Polarisation gegenüber der Referenzelektrode). Wiederholen Sie diese Messung für jeden Arbeitselektrode in den Mikrokanälen.
5. Messung der DNA-Hybridisierung (zuführen für jede nicht-komplementären und komplementären ssDNA-Ziel).
   1. Füllen Sie die Mikrokanäle mit Ziel ssDNA Messlösung von 4x konzentriert SSC-Puffer mit 1 uM der Ziel ssDNA, und Inkubation für 20 min. Messung der DNA nach Schritt 3.4.

Ergebnisse

Eine steuerbare und genaue Herstellungsverfahren für die Versuchsvorrichtung ist wesentlich, in der Forschung. Es erlaubt Forschern, reproduzierbare und Hochdurchsatz-Experimenten erhalten. Hier haben wir eine hohe Ausbeute, hohe Reproduzierbarkeit Mikroprozess eines mikrofluidischen Biochip-basierten elektrochemischen (Abbildung 1) gezeigt. Mit einer niedrigen Ausfallrate haben nur wenige Geräte Haft Fragen, die Leckage Lösung führen gezeigt. Um die elektrochemische Aktivität des Biochips zu valid...

Diskussion

Unsere Verfahren zeigen die Herstellung eines mikrofluidischen Basis elektro Biochip und seine Verwendung für die DNA-Hybridisierungsereignissen Analyse. Durch eine hohe Ausbeute gesteuert Mikroprozess entwickeln wir ein Gerät der Mikrokanäle mit einer Reihe von elektrochemischen Wandler integriert zusammen. Wir haben gesteuerten Bearbeitungsparameter für die Photolithographie Verfahren der elektrochemischen Chip und der mikrofluidischen Kanal Form durch einen iterativen Ansatz entwickelt. Diese Schritte stellen Lei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'' Silicon wafer	Ultrasil	4-5664	Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1")	Microchem		positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2")	Hoechst Celanse		positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3")	Microchem		negative photoresist
Gold etchant	Transene	TFA	No dilution
Chromium etchant	Transene	1020AC	No dilution
PDMS elastomer	Dow Corning	3097366 1004
PDMS curing agent	Dow Corning	3097358 1004
Biopsy punching tool	Healthlink	BP20
Tygon flexible tubing	Cole Parmer	R 3603	0.015"
Tygon flexible adapter	Cole Parmer	06417-41	0.0625"
1 ml syringe	Beckton-Dickenson	301025
Monobasic potassium phosphate	Fluka	1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Sigma	RES20765-A7
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Aldrich	C4706
6-mercapto-1-hexanol	Aldrich	451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer	Sigma	93017
Potassium hexacyanoferrate(III)	Aldrich	455946
Complementary ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit	AJA International	ATC 1800-V	For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system	Denton	Custom-built	For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat	CH Instruments	660D
Syringe pump	KD Scientific	KDS230