Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Resumen

Se presenta un biochip electroquímico basado en microfluídico para la detección de la hibridación de ADN. Tras ssDNA sonda funcionalización, la especificidad, sensibilidad y límite de detección se estudian con objetivos ssDNA complementarias y no complementarias. Resultados ilustran la influencia de los eventos de hibridación de ADN en el sistema electroquímico, con un límite de detección de 3,8 nM.

Resumen

La miniaturización de los procedimientos analíticos de sobremesa en la escala micro proporciona ventajas significativas en cuanto a tiempo de reacción, el coste, y la integración de las etapas de pre-procesamiento. La utilización de estos dispositivos hacia el análisis de los eventos de hibridación de ADN es importante porque ofrece una tecnología para la evaluación en tiempo real de los biomarcadores en el punto de atención para diversas enfermedades. Sin embargo, cuando la huella dispositivo disminuye el dominio de diversas ampliaciones de los fenómenos físicos. Estos fenómenos influyen en la precisión de fabricación y fiabilidad de funcionamiento del dispositivo. Por lo tanto, hay una gran necesidad de fabricar con precisión y operar estos dispositivos en una manera reproducible con el fin de mejorar el rendimiento global. A continuación, describimos los protocolos y los métodos utilizados para la fabricación y el funcionamiento de un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis preciso de los eventos de hibridación de ADN. El biochip se compone de dos partes: un chip de microfluidos contres micro-canales paralelos hechos de polidimetilsiloxano (PDMS), y un Arrayed electroquímica micro-chip de 3 x 3. Los eventos de hibridación de ADN se detectan usando un análisis de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS). El análisis EIS permite monitoreo de las variaciones de las propiedades del sistema electroquímico que son dominantes en estas escalas de longitud. Con la capacidad para monitorizar los cambios tanto de transferencia de carga y la resistencia difusional con el biosensor, se demuestra la selectividad a los objetivos de ADNss complementarios, un límite de detección calculado de 3,8 nM, y una reactividad cruzada del 13% con otros ssDNA no complementaria siguiente 20 min de incubación. Esta metodología puede mejorar el rendimiento de dispositivos miniaturizados por elucidar sobre el comportamiento de la difusión en el régimen de micro-escala y al permitir el estudio de los acontecimientos de hibridación de ADN.

Introducción

Lab-on-a-chip de microfluidos dispositivos (LOC) proporciona numerosas ventajas en el diagnóstico clínico, monitoreo ambiental y la investigación biomédica. Estos dispositivos utilizan canales de microfluidos para controlar el flujo de fluido a las regiones del chip donde una variedad de procedimientos puede tener lugar incluida la mezcla de reactivo, de afinidad basada en la unión, transducción de señales, y la célula de cultivo de ^1-4. Microfluídica proporciona muchas ventajas sobre las herramientas de diagnóstico clínicos convencionales, tales como lectores de placas de micropocillos o ensayos de cambio de gel electroforético. Los dispositivos microfluídicos requieren de 2 a 3 órdenes de magnitud (nanolitros en oposición a microlitros) menos reactivos para llevar a cabo ensayos similares. Además, estos dispositivos pueden aumentar la velocidad por la cual algunos eventos biológicos se producen debido al confinamiento más pequeña de las especies dentro de los canales ^5,6. En tercer lugar, los sensores pueden ser integrados dentro de los dispositivos de microfluidos que utilizan técnicas de litografía y aguafuerte, que pueden proporcionar Detectio sin etiquetasn. Por último, estos dispositivos son baratos de producir y requieren poco trabajo por parte del técnico para operar ^7-10.

Detección libre de etiquetas típicamente se realiza usando un transductor óptico o eléctrico. Los dispositivos ópticos pueden presentar un mejor rendimiento de detección debido a la interferencia menor con analitos en la muestra. Sin embargo, su rendimiento se ve comprometida en los casos en que el fondo de la muestra tiene la misma longitud de onda de resonancia como el sensor ^11. Hay muchas ventajas de utilizar las señales eléctricas para realizar la detección química y biológica en los sistemas de microfluidos. La fabricación es inherentemente menos complicado ya que estos sensores por lo general sólo requieren electrodos estampados para operar. Además, las señales eléctricas pueden conectarse directamente con la mayoría del equipo de medición, mientras que otras modalidades de señal pueden requerir un transductor para convertir la señal ^12-15. Sensores eléctricos comúnmente medir los cambios en impedance ^16,17, capacitancia ^18, o redox actividad ^19. Sin embargo, nuevos desafíos se presentan como estos sistemas son miniaturizados. Los retos más importantes para superar incluyen: preparación de la muestra y la mezcla de fluidos (debido a el volumen de muestra bajo y el número de Reynolds), efectos físicos y químicos (incluyendo las fuerzas capilares, rugosidad de la superficie, las interacciones químicas entre los materiales de construcción y analitos), bajo señalización relación a ruido (producido por el área reducida de la superficie y volumen) ^20-23, y la interferencia potencial de analitos electro-activas en muestras biológicas complejas (por ejemplo, de sangre y de saliva). Investigaciones posteriores de estos efectos se traducirá en las directrices para una fabricación precisa y manejo de estos dispositivos de una manera reproducible que mejoren en su desempeño general.

Detección de la hibridación de ADN se utiliza ampliamente para diagnosticar trastornos genéticos ^24,25 y diversas formas de Cancer ^26. Cada año, varias cepas de la gripe se identifican en los pacientes que utilizan los resultados de las técnicas de hibridación de ADN ^27. El virus de la gripe por sí sola representa 36.000 muertes cada año en los Estados Unidos ^28. Tales ejemplos podrían beneficiarse de un dispositivo de sobremesa de microfluidos que puede realizar las mismas técnicas de ensayo como un ensayo de desplazamiento en gel de lector de placas o con bajo volumen de muestra y en una fracción del costo sin sacrificar la sensibilidad o especificidad. Debido a las muchas ventajas de detección electroquímica libre de etiquetas, se ha utilizado ampliamente para la detección de eventos de hibridación de ADN ^29,30. Una configuración donde los electrodos escala macro (en el rango de milímetros) se sumergen en vasos de precipitados con la solución de interés puede ser utilizado para proporcionar datos muy sensibles con respecto a la cinética de unión de secuencias de ADN de cadena sencilla a sus emparejan secuencias complementarias. Recientemente, ha habido algunos avances en la incorporación de la detección electroquímica en microfluidics para la hibridación de ADN. Se han realizado estudios en relación con la cinética de hibridación ³¹ y la integración de sensores para la detección de ¹⁵ en los canales de microfluidos. Sin embargo, todavía existe una necesidad de un dispositivo de microfluidos rápida de alto rendimiento que puede analizar los eventos de hibridación de ADN en paralelo sin complicados pasos de preparación de muestras.

El dispositivo se presenta en este trabajo proporciona una plataforma que permite múltiples interacciones que se proyectarán en paralelo y sin complicados pasos de preparación de muestras. Nuestro protocolo presenta la forma de microfluidos basada en biochips electroquímicos se microfabricados con la tecnología de sistemas micro-electromecánicos (MEMS) ^32,33. Se describe el proceso de fabricación tanto del chip de microfluidos, hecho de polidimetilsiloxano (PDMS), y el chip electroquímica, compuesto por una matriz de electrodos. La funcionalización química del biochip con ssDNA sondas también se aborda. Finalmente, el Abildad del biosensor para detectar específicamente y analizar los objetivos de ssDNA se demuestra. En general, el biochip electroquímico basado en microfluidos es una técnica rápida y el análisis de alto rendimiento. Se puede utilizar para investigar las interacciones entre moléculas biológicas y transductores de conductores, y se puede utilizar en una variedad de aplicaciones de laboratorio en un chip.

Protocolo

1. microfabricación del chip de microfluidos

1. Preparar Electroquímica Viruta
   1. Patrón Oro Electrodos
      1. Enjuague un espacio en blanco 4 '' oblea de silicio (calidad de primer grado) con acetona, metanol, e isopropanol ("AMI" limpio). Enjuague el isopropanol de la oblea con agua desionizada (DI) seguido de secado con pistola de N _2.
      2. Crecer una gruesa capa de pasivación 1 m _SiO2 con la deposición de vapor químico mejorada por plasma herramienta (PECVD). Depositar una capa de espesor de 200 Å de cromo seguido de una capa de espesor de 2.000 Å de oro con una herramienta de pulverización catódica DC.
      3. Spin "PR1" fotorresistente positivo (parámetros de giro: 3.000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) para crear película uniforme ~ 1,6 m de espesor. Pre-hornear la oblea durante 1 min a 100 ° C en una placa caliente.
      4. Exponer la oblea con 190 mJ / cm ² a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Desarrollar la oblea durante 30 segundos en 352 developer y enjuague la oblea con DI y secar con _N2 arma.
      5. Grabe el oro con grabador de oro durante 1,5 min. Grabe el cromo con mordiente de cromo para el ~ 30 seg. Enjuague la oblea con DI y secar con _N2 arma.
      6. Pele el fotoprotector con "AMI" procedimiento de limpieza.
         NOTA: OXIDANTE FUERTE Y POTENCIALMENTE EXPLOSIVA.
      7. Limpie la oblea con 4: 1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ mezcla ("Piranha" limpia) durante 1 min. Enjuague la oblea con DI y secar con _N2 arma.
   2. Patrón Platino Electrodos
      1. Spin "PR2" fotorresistente positivo (parámetros de giro: 3.000 rpm, 1000 rpm / s, 30 s) para crear película uniforme ~ 1.4 m de espesor. Pre-hornear la oblea durante 1 min a 100 ° C en una placa caliente.
      2. Exponer la oblea con 30 mJ / cm ² a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Hornee la oblea durante 45 segundos a 125 ° C en una placa caliente. Flood exponerla oblea con 1.000 mJ / cm ² a 405 nm de longitud de onda sin una fotomáscara. Desarrollar la oblea durante 2 minutos en 6: 1 desarrollador AZ400K y enjuague la oblea con DI y secar con _N2 arma.
      3. Deposita una capa gruesa 400 de titanio seguido de una capa gruesa de 1.600 Å de platino usando un sistema de evaporación por haz de electrones.
      4. Levante fotorresistente en un baño de acetona a ultrasonidos durante 5 min, seguido de enjuague con acetona e isopropanol. Enjuague la oblea con DI y secar con _N2 arma.
2. Preparar Canales ensayo
   1. Preparar Molde para Canales de ensayo
      1. Enjuague un espacio en blanco 4 '' oblea de silicio (grado de calidad de prueba) con "AMI" procedimiento de limpieza. Enjuague el isopropanol de la oblea con DI seguido de secado con pistola de N _2.
      2. Spin "PR3" fotorresistente negativo (parámetros de hilatura de 2 pasos:. Paso uno - 600 rpm, 120 rpm / s, 10 s Paso dos - 1.150 rpm, 383 rpm / seg,27 seg) para crear película uniforme ~ 100 m de espesor. Pre-hornear la oblea en una placa caliente (parámetros de cocción de 2 pasos:. Paso uno - la rampa encima de la temperatura ambiente a 65 ° C a 300 ° C / hr y mantenga la temperatura durante 10 minutos Paso 2 - rampa de hasta 95 ° C a 300 ° C / hr y temperatura de mantenimiento durante 30 min).
      3. Exponer la oblea con 2.500 mJ / cm ² a 405 nm de longitud de onda a través de una fotomáscara. Post-hornear la oblea a acelerar hasta 95 ° C a 300 ° C / hr y mantenga la temperatura durante 10 minutos en un plato caliente. Desarrollar la oblea durante 10 min en propilenglicol monometil éter acetato (PGMEA) desarrollador. Enjuague la oblea con isopropanol y se seca con N ₂ arma.
   2. Fabrique Canales ensayo
      1. Preparar 10: 1 polidimetilsiloxano (PDMS) mezcla (20 g de elastómero, 2 g de agente de curado) y desgasificar completamente en una cámara de vacío durante 20 min.
      2. Definir un recinto alrededor de la oblea molde con papel de aluminio y verter lentamente el curado PDMSsobre el molde.
      3. Hornear el molde con el PDMS en un horno de caja (parámetros de cocción de 2 pasos:. Paso uno - 5 min rampa encima de la temperatura ambiente a 80 ° C Paso 2 - mantenga a 80 ° C durante 17 min).
      4. Despegue la PDMS del molde y colocar en papel de aluminio. Cortar los chips de ensayo con un cuchillo cirujano, definir agujeros con una herramienta de troquelado de la biopsia.

2. Montar el dispositivo

1. Alinear manualmente los canales de ensayo PDMS con los electrodos de trabajo en el chip electroquímica. PDMS pega bien al chip electroquímica, el sellado de los canales y la prevención de fugas.
2. Conecte un tubo flexible (OD 0.087 '' y el ID de 0,015 '') a un codo de plástico o conector recto mediante un tubo flexible corto como un adaptador (OD 0.1875 '' y el ID de 0.0625 ''). Fije los conectores a cada una de las entradas perforados en el dispositivo.
3. Conectar una jeringa en el otro extremo deel tubo y coloque la jeringa en una bomba de jeringa. Alternativamente cambiar el conjunto de una jeringa, un tubo, y un conector de acuerdo con el procedimiento paso requerido en la sección 3 y su solución correspondiente.

3. Analizar ADN Hibridación

NOTA: Introducir cada solución lentamente en el canal a una velocidad de flujo de 200 l / h hasta que se llena todo el canal.

1. Funcionalizar cada microcanal vertical con una secuencia de sonda de ADN monocatenario diferente (realizar en paralelo a los 3 microcanales verticales separadas):
   1. Llenar cada microcanal con una solución diferente de incubación sonda de ADN monocatenario (tampón de fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, 10 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), y 1 sonda de ssDNA M), y se incuba durante 1 hora seguido de lavado del microcanal con PBS.
   2. Llenar los microcanal con una solución que contiene 1 mM de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) en un tampón de PBS 10 mM, NaCl 100 mM y 1,395 mM TCEP, y incubate durante 1 hora seguido de lavado de la microcanal con PBS.
2. Levante el PDMS, girar 90 ° a una orientación horizontal, y colocar hacia abajo para mostrar filas separadas de cámaras de reacción con cada fila que contiene un contador único y electrodo de referencia (Figura S1).
3. Rellena los microcanales con solución de medición de control de 4x concentran citrato sódico salino tampón (SSC), y se incuba durante 20 min.
4. Medición de fondo: Completa los microcanales con 5 mM de ferricianuro de ferrocianuro / 5 mM en solución de PBS y registrar los valores de impedancia del sistema electroquímico para diferentes frecuencias (espectroscopia de impedancia electroquímica; EIS) usando un potenciostato conectado a la de trabajo, contador, y electrodos de referencia ( EIS parámetros: intervalo de frecuencia de 1 MHz a 0,1 Hz, 10 puntos de datos de frecuencia por década, 25 mV de amplitud, 5 mV de polarización frente al electrodo de referencia). Repetir esta medición para cada electrodo de trabajo en los microcanales.
5. Mida la hibridación de ADN (realizar para cada objetivo ssDNA no complementario y complementaria).
   1. Rellena los microcanales con destino solución de medición ssDNA de 4x concentrado tampón SSC que contiene 1 M de la meta de ssDNA, y se incuba durante 20 min. Mida el ADN según la etapa 3.4.

Resultados

Un proceso de fabricación controlable y precisa para el dispositivo experimental es esencial en la investigación. Se permite a los investigadores obtener rendimiento experimentos reproducibles y altas. Aquí hemos demostrado un alto rendimiento, el proceso de microfabricación alta reproducibilidad de un biochip electroquímico basado en microfluídico (Figura 1). Con una baja tasa de fracaso, pocos dispositivos han mostrado problemas de unión que llevan a la solución de las fugas. Con el fin de val...

Discusión

Nuestros procedimientos demuestran la fabricación de un biochip electroquímico basado en microfluidos y su utilización para el análisis de los eventos de hibridación de ADN. A través de un proceso de microfabricación de alto rendimiento controlada desarrollamos un dispositivo compuesto por canales microescala integrados con una serie de transductores electroquímicos. Hemos ideado parámetros de procesamiento controlados para el procedimiento de fotolitografía del chip electroquímica y el molde a través de un ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'' Silicon wafer	Ultrasil	4-5664	Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1")	Microchem		positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2")	Hoechst Celanse		positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3")	Microchem		negative photoresist
Gold etchant	Transene	TFA	No dilution
Chromium etchant	Transene	1020AC	No dilution
PDMS elastomer	Dow Corning	3097366 1004
PDMS curing agent	Dow Corning	3097358 1004
Biopsy punching tool	Healthlink	BP20
Tygon flexible tubing	Cole Parmer	R 3603	0.015"
Tygon flexible adapter	Cole Parmer	06417-41	0.0625"
1 ml syringe	Beckton-Dickenson	301025
Monobasic potassium phosphate	Fluka	1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Sigma	RES20765-A7
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Aldrich	C4706
6-mercapto-1-hexanol	Aldrich	451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer	Sigma	93017
Potassium hexacyanoferrate(III)	Aldrich	455946
Complementary ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit	AJA International	ATC 1800-V	For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system	Denton	Custom-built	For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat	CH Instruments	660D
Syringe pump	KD Scientific	KDS230