Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Riepilogo

Vi presentiamo un biochip elettrochimico basato microfluidica-per la rilevazione ibridazione DNA. A seguito di ssDNA sonda funzionalizzazione, la specificità, sensibilità, e il limite di rilevazione sono studiati con obiettivi ssDNA complementari e non complementari. I risultati illustrano l'influenza degli eventi di ibridazione DNA sul sistema elettrochimico, con un limite di rilevazione di 3,8 nM.

Abstract

La miniaturizzazione delle procedure analitiche da banco in micro-scala offre vantaggi significativi per quanto riguarda il tempo di reazione, costi, e l'integrazione delle fasi di pre-elaborazione. Utilizzando questi dispositivi verso l'analisi degli eventi di ibridazione del DNA è importante perché offre una tecnologia per la valutazione in tempo reale dei biomarcatori presso il punto di cura per varie malattie. Tuttavia, quando l'impronta dispositivo diminuisce il dominio di vari aumenti di fenomeni fisici. Questi fenomeni influenzano la precisione di fabbricazione e l'affidabilità di funzionamento del dispositivo. Pertanto, vi è una grande necessità di fabbricare accuratamente e farli funzionare in modo riproducibile al fine di migliorare le prestazioni complessive. Qui, descriviamo i protocolli ei metodi utilizzati per la fabbricazione e il funzionamento di un biochip elettrochimica microfluidica-based per l'analisi accurata di eventi di ibridazione DNA. Il biochip è composto di due parti: un chip microfluidica contre micro-canali paralleli fatti di polidimetilsilossano (PDMS), e un Arrayed microchip elettrochimica 3 x 3. Gli eventi di ibridazione DNA vengono rilevati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) analisi. L'analisi EIS consente variazioni di monitoraggio delle proprietà del sistema elettrochimico che sono dominanti in queste scale di lunghezza. Con la possibilità di monitorare le variazioni sia di trasferimento di carica e la resistenza diffusionale con il biosensore, dimostriamo la selettività di obiettivi ssDNA complementari, un limite di rilevazione calcolato di 3,8 nM, ed una cross-reattività 13% con altri ssDNA non complementare dopo 20 min di incubazione. Questa metodologia può migliorare le prestazioni dei dispositivi miniaturizzati da chiarire sul comportamento di diffusione al regime micro-scala e consentendo lo studio di eventi di ibridazione DNA.

Introduzione

Lab-on-a-chip microfluidica (LOC) dispositivi offrono numerosi vantaggi in diagnostica clinica, il monitoraggio ambientale e la ricerca biomedica. Questi dispositivi utilizzano canali microfluidici per controllare il flusso del fluido alle regioni del chip dove una varietà di procedure può avvenire compresa la miscelazione dei reagenti, affinità di base vincolante, trasduzione del segnale, e la cella coltura ^1-4. Microfluidica offre molti vantaggi rispetto ai tradizionali strumenti diagnostici clinici, quali lettori di piastra Elisa o elettroforetica saggi di gel shift. Dispositivi microfluidici richiedono 2 o 3 ordini di grandezza (nanolitri al contrario di microlitri) minor numero di reagenti per eseguire test simili. Inoltre, questi dispositivi possono aumentare la velocità con cui alcuni eventi biologici si verificano a causa del confinamento più piccolo della specie all'interno dei canali ^5,6. In terzo luogo, i sensori possono essere integrati all'interno di dispositivi microfluidici che utilizzano tecniche di litografia e incisione, che possono fornire detectio senza etichettan. Infine, questi dispositivi sono poco costosi da produrre e richiedono poco lavoro da parte del tecnico di operare ^7-10.

Rilevamento libero-Label in genere viene eseguita utilizzando un trasduttore ottico o elettrico. Dispositivi ottici possono presentare migliori prestazioni di rilevamento a causa della minore interferenza con analiti nel campione. Tuttavia, le loro prestazioni è compromessa nel caso in cui lo sfondo del campione ha la stessa lunghezza d'onda di risonanza del sensore ^11. Ci sono molti vantaggi di utilizzare segnali elettrici per eseguire il rilevamento biologico e chimico in sistemi microfluidici. La fabbricazione è intrinsecamente meno complicata dato che questi sensori in genere richiedono solo elettrodi fantasia per operare. Inoltre, i segnali elettrici possono essere interfacciati direttamente con la maggior parte delle apparecchiature di misura, mentre altre modalità di segnalazione possono richiedere un trasduttore per convertire il segnale ^12-15. Sensori elettrici comunemente misurano variazioni di impedance ^16,17, capacità ^18, o redox di attività ^19. Tuttavia, le nuove sfide che si presentano come tali sistemi sono miniaturizzati. Le sfide più importanti da superare comprendono: preparazione del campione e la miscelazione dei fluidi (a causa del basso volume del campione e il numero di Reynolds), effetti fisici e chimici (tra cui forze capillari, rugosità superficiale, le interazioni chimiche tra i materiali da costruzione e di analiti), basso rapporto segnale a-rumore (prodotto dalla zona ridotta superficie e di volume) ^20-23, e il potenziale interferenza da analiti elettro-attivi in campioni biologici complessi (ad esempio, sangue e saliva). Ulteriori analisi di questi effetti si tradurrà in linee guida per una realizzazione accurata e il funzionamento di questi dispositivi in ​​modo riproducibile che potrebbero migliorare la loro performance complessiva.

Rilevazione ibridazione DNA è ampiamente utilizzato per diagnosticare malattie genetiche ^24,25 e varie forme di cancer ^26. Ogni anno, più ceppi di influenza sono identificati nei pazienti che utilizzano i risultati di tecniche di ibridazione del DNA ^27. Il virus dell'influenza da solo incide per 36.000 morti ogni anno negli Stati Uniti ^28. Tali esempi potrebbero beneficiare di un dispositivo da banco microfluidica in grado di eseguire le stesse tecniche di analisi come un lettore di piastre o gel shift assay con basso volume del campione e ad una frazione del costo senza sacrificare la sensibilità o la specificità. A causa dei numerosi vantaggi del libero-label rilevamento elettrochimico, è stato ampiamente utilizzato per il rilevamento di eventi di ibridazione DNA ^29,30. Una configurazione in cui gli elettrodi macro-scala (nella gamma millimetro) sono immersi in bicchieri con la soluzione di interesse può essere utilizzato per fornire dati molto sensibili riguardanti la cinetica di legame delle singole sequenze di DNA non recuperabili alle loro sequenze complementari corrispondenti. Recentemente, ci sono stati alcuni progressi nella incorporando rilevamento elettrochimico in microfluidics per ibridazione DNA. Gli studi sono stati condotti per quanto riguarda la cinetica di ibridazione ³¹ e l'integrazione di sensori per il rilevamento a ¹⁵ canali microfluidici. Tuttavia, esiste ancora la necessità di un rapido throughput elevato dispositivo di microfluidica in grado di analizzare gli eventi di ibridazione DNA in parallelo senza complicate fasi di preparazione del campione.

Il dispositivo presentato in questo lavoro fornisce una piattaforma che permette molteplici interazioni siano proiettati in parallelo e senza complicate fasi di preparazione del campione. Il nostro protocollo presenta come microfluidica basata biochip elettrochimici sono microfabbricati con sistemi micro-elettromeccanici (MEMS), la tecnologia ^32,33. Descriviamo il processo di fabbricazione sia del chip microfluidico, fatta di polidimetilsilossano (PDMS), e il chip elettrochimica, costituito da una matrice di elettrodi. La funzionalizzazione chimica del biochip con sonde ssDNA si rivolge anche. Infine, il Abillità del biosensore per rilevare in modo specifico e analizzare obiettivi ssDNA è dimostrata. Nel complesso, il biochip elettrochimica basata microfluidica-è una tecnica rapida e di analisi high-throughput. Può essere usato per studiare le interazioni tra le molecole biologiche e trasduttori di conduzione, e può essere utilizzata in una varietà di applicazioni lab-on-a-chip.

Protocollo

1 Microfabbricazione del Microfluidic Chip

1. Preparare elettrochimica Chip
   1. Modello Oro Elettrodi
      1. Risciacquare un vuoto 4 '' wafer di silicio (qualità di prima qualità) con acetone, metanolo e isopropanolo ("AMI" clean). Sciacquare il isopropanolo dal wafer con acqua deionizzata (DI), seguita da asciugatura con N ₂ pistola.
      2. Crescere uno spesso strato di SiO ₂ 1 micron con passivazione chimica da fase vapore deposizione al plasma (PECVD) strumento. Depositare uno strato spesso 200 di cromo seguito da uno strato spesso un 2000 d'oro con uno strumento di sputtering DC.
      3. Spin "PR1" photoresist positivo (parametri di filatura: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) per creare pellicola uniforme ~ 1.6 micron di spessore. Pre-cuocere il wafer per 1 min a 100 ° C su una piastra calda.
      4. Esporre la cialda con 190 mJ / cm ² a 405 nm di lunghezza d'onda attraverso un fotomaschera. Sviluppare il wafer per 30 sec a 352 developer e sciacquare la cialda con DI e asciugare con N ₂ pistola.
      5. Etch l'oro con oro mordenzante per 1,5 min. Etch cromo cromo mordenzante per ~ 30 sec. Sciacquare il wafer con DI e asciugare con N ₂ pistola.
      6. Striscia il photoresist con "AMI" procedura di pulizia.
         NOTA: OSSIDANTE FORTE E POTENZIALMENTE ESPLOSIVA.
      7. Pulire la cialda con 4: 1 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ miscela ("Piranha" clean) per 1 min. Sciacquare il wafer con DI e asciugare con N ₂ pistola.
   2. Modello Platinum Elettrodi
      1. Spin "Pr2" photoresist positivo (parametri di filatura: 3.000 rpm, 1000 rpm / sec, 30 sec) per creare pellicola uniforme ~ 1.4 micron di spessore. Pre-cuocere il wafer per 1 min a 100 ° C su una piastra calda.
      2. Esporre la cialda con il 30 mJ / cm ² a 405 nm di lunghezza d'onda attraverso un fotomaschera. Cuocere il wafer per 45 sec a 125 ° C su una piastra calda. Flood esporreil wafer con 1.000 mJ / cm ² a 405 nm senza fotomaschera. Sviluppare il wafer per 2 min a 6: 1 sviluppatore AZ400K e sciacquare la cialda con DI e asciugare con N ₂ pistola.
      3. Depositare uno strato dello spessore di 400 Å di titanio seguito da uno strato di spessore 1,600 Å di platino mediante un sistema di evaporazione e-beam.
      4. Sollevare fotoresist in un bagno di acetone ultrasonicated per 5 minuti seguita da risciacquo con acetone e isopropanolo. Sciacquare il wafer con DI e asciugare con N ₂ pistola.
2. Preparare Canali Assay
   1. Preparare Stampo per canali Assay
      1. Risciacquare un vuoto 4 '' wafer di silicio (grade qualità test) con "AMI" procedura di pulizia. Sciacquare il isopropanolo dal wafer con DI seguita da asciugatura con N ₂ pistola.
      2. Spin "PR3" photoresist negativo (parametri di filatura 2-step:. Passo uno - 600 rpm, 120 rpm / sec, 10 sec Fase due - 1.150 rpm, 383 rpm / sec,27 sec) per creare pellicola uniforme ~ 100 micron di spessore. Pre-cuocere la cialda su una piastra calda (parametri di cottura 2-step:. Passo uno - rampa da temperatura ambiente a 65 ° C a 300 ° C / ora e mantenere la temperatura per 10 min Fase 2 - rampa fino a 95 ° C a 300 ° C / ora e la temperatura attesa per 30 min).
      3. Esporre la cialda con 2.500 mJ / cm ² a 405 nm di lunghezza d'onda attraverso un fotomaschera. Post-cuocere il wafer da rampa fino a 95 ° C a 300 ° C / ora e mantenere la temperatura per 10 minuti su un piatto caldo. Sviluppare il wafer per 10 min in glicole propilenico MONOMETILETERE Acetato (PGMEA) sviluppatore. Sciacquare il wafer con isopropanolo e asciugare con N ₂ pistola.
   2. Realizzare Canali Assay
      1. Preparare 10: 1 polidimetilsilossano (PDMS) miscela (20 g di elastomero, 2 g di induritore) e completamente degassamento in una camera a vuoto per 20 min.
      2. Definire un recinto attorno alla cialda stampo con un foglio di alluminio e versare lentamente la polimerizzato PDMSsopra lo stampo.
      3. Cuocere lo stampo con il PDMS in un forno scatola (parametri di cottura 2-step:. Passo uno - 5 min rampa da temperatura ambiente a 80 ° C Fase 2 - tenere a 80 ° C per 17 min).
      4. Togliete la PDMS dallo stampo e posto su un foglio di alluminio. Tagliare i chip di analisi con un coltello chirurgo, definire fori con uno strumento di biopsia di punzonatura.

2 Montare il dispositivo

1. Allineare manualmente i canali test PDMS con gli elettrodi di lavoro sul chip elettrochimica. PDMS aderire bene al chip elettrochimica, sigillando i canali e prevenire perdite.
2. Collegare un tubo flessibile (OD 0,087 '' e ID 0,015 '') per un gomito di plastica o connettore diritto con un breve tubo flessibile come un adattatore (OD 0,1875 '' e ID 0,0625 ''). Collegare i connettori a ciascuna delle bocche-forati nel dispositivo.
3. Collegare una siringa all'altra estremità delil tubo e posizionare la siringa in una pompa a siringa. In alternativa modificare il set di una siringa, un tubo, e un connettore in base alla fase di procedura necessaria nella sezione 3 e la sua soluzione corrispondente.

3 Analizzare Ibridazione DNA

NOTA: Introdurre ciascuna soluzione lentamente nel canale ad una portata di 200 l / h fino a quando l'intero canale è riempito.

1. Funzionalizzare ogni microcanali verticale con una differente sequenza di sonda ssDNA (eseguire in parallelo ai 3 microcanali verticali separate):
   1. Riempire ogni microcanali con una diversa soluzione della sonda di incubazione ssDNA (tampone fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, 10 mM tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP), e 1 mM sonda ssDNA), e incubare per 1 ora, seguito da risciacquo del microcanali con PBS.
   2. Riempire i microcanali con una soluzione contenente 1 mM di 6-mercapto-1-esanolo (MCH) in tampone di PBS 10 mM, NaCl 100 mM e 1.395 TCEP mM, e incubate per 1 ora seguita dal risciacquo del microcanali con PBS.
2. Sollevare il PDMS, ruotare di 90 ° a un orientamento orizzontale, e mettere giù per esporre righe separate di camere di reazione con ciascuna riga contenente un contatore unico ed elettrodo di riferimento (Figura S1).
3. Compila i microcanali con una soluzione di misurazione di controllo di 4x concentrati citrato salina-sodio (SSC) del buffer e incubare per 20 min.
4. Misurazione del fondo: Compilare i microcanali con 5 mM ferricianuro / 5 mM ferrocianuro in soluzione PBS e registrare i valori di impedenza del sistema elettrochimico per diverse frequenze (spettroscopia di impedenza elettrochimica; EIS) con un potenziostato collegato al lavoro, bancone, e gli elettrodi di riferimento ( EIS parametri: gamma di frequenza da 1 MHz a 0.1 Hz, 10 punti dati di frequenza per ogni decennio, 25 mV di ampiezza, 5 mV polarizzazione contro l'elettrodo di riferimento). Ripetere questa misura per ogni elettrodo lavoro nei microcanali.
5. Misurare ibridazione DNA (eseguire per ogni target ssDNA non-complementari e complementare).
   1. Riempire i microcanali con destinazione soluzione di misura ssDNA di 4x concentrato tampone SSC contenente 1 mM del target ssDNA, e incubare per 20 min. Misurare il DNA secondo al punto 3.4.

Risultati

Un controllabile e accurato processo di fabbricazione per il dispositivo sperimentale è essenziale nella ricerca. Esso consente ai ricercatori di ottenere esperimenti riproducibili e di throughput elevati. Qui abbiamo dimostrato un rendimento elevato, processo microfabbricazione alta riproducibilità di un biochip elettrochimica microfluidica-based (Figura 1). Con un tasso di fallimento basso, pochi dispositivi hanno mostrato problemi di incollaggio che portano a perdite di soluzione. Al fine di valida...

Discussione

Le nostre procedure dimostrano la fabbricazione di un biochip elettrochimica basata microfluidica e il suo utilizzo per l'analisi di eventi di ibridazione del DNA. Attraverso un processo di microfabbricazione alta resa controllata sviluppiamo un dispositivo costituito da canali microscala, integrato con un insieme di trasduttori elettrochimici. Abbiamo ideato parametri di elaborazione controllate per la procedura di fotolitografia del chip elettrochimica e lo stampo canale microfluidica attraverso un approccio itera...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'' Silicon wafer	Ultrasil	4-5664	Single side polished; P-type; Boron doped; Orientation 1-0-0; Thickness 500 micron; Resistance 10-20 ohm·cm
Shipley 1813 photoresist ("PR1")	Microchem		positive photoresist
AZ5214 photoresist ("PR2")	Hoechst Celanse		positive photoresist
SU-8 50 photoresist ("PR3")	Microchem		negative photoresist
Gold etchant	Transene	TFA	No dilution
Chromium etchant	Transene	1020AC	No dilution
PDMS elastomer	Dow Corning	3097366 1004
PDMS curing agent	Dow Corning	3097358 1004
Biopsy punching tool	Healthlink	BP20
Tygon flexible tubing	Cole Parmer	R 3603	0.015"
Tygon flexible adapter	Cole Parmer	06417-41	0.0625"
1 ml syringe	Beckton-Dickenson	301025
Monobasic potassium phosphate	Fluka	1551139
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Sigma	RES20765-A7
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
tris(2-carboxyethyl)phosphine	Aldrich	C4706
6-mercapto-1-hexanol	Aldrich	451088
20x concentrated saline-sodium citrate buffer	Sigma	93017
Potassium hexacyanoferrate(III)	Aldrich	455946
Complementary ssDNA #1	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-GGGACGTCCACGGAGCGCTA TCGGAGCTTT-3’
Target ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA ATCGATGAGT-3’
Complementary ssDNA #2	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-ACTCATCGATTCGTCAATGA CCTGACCCGT-3’
Target ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA CCCATGATGA-3’
Complementary ssDNA #3	Integrated DNA Technologies (IDT)	100 nmole DNA oligo	5’-TCATCATGGGTCTAACTACT GGATCTAGGT-3’
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)	Oxford Instruments	PlasmaLab System 100	Chamber pressure 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C, RF power 20 W, Gasses: a) N2O flow rate 710 sccm; b) a composition of 5% SiH4 and 95% N2 gasses flow rate 170 sccm, SiO2 growth rate 690 Å/min.
DC sputtering unit	AJA International	ATC 1800-V	For Chrome: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 10 nm/min. For Gold: Chamber pressure 10 mTorr, Argon flow rate 20 sccm, Supplied DC power 200 W, Sputter rate 36 nm/min.
E-beam evaporation system	Denton	Custom-built	For Titanium: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 6-10 Å/sec. For Platinum: Chamber pressure < 2 x 10-6 Torr, Supplied power to the e-gun 7.5 kW, Filament current 150-200 mA, Evaporation rate 2-3 Å/sec.
Potentiostat	CH Instruments	660D
Syringe pump	KD Scientific	KDS230